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利用慢病毒载体制备转基因小鼠和牛胚胎的研究

作　者: 孙克宁
导　师: 林峰
学　校: 河南农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 慢病毒载体精子介导慢病毒包装转基因
分类号: S814.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

慢病毒载体源于HIV-1前病毒(HIV-1 provirus)基因组。其宿主范围广,可以感染分裂和非分裂细胞;整合效率高,并可以使外源基因稳定长期地表达。慢病毒载体已经成功地应用于多种转基因动物的生产。本试验使用三质粒系统的慢病毒载体,它属于自我失活性载体,并含有WPRE等调控元件。Fat-1基因来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans),其表达产物为一种ω-3不饱和脂肪酸脱氢酶。可以将ω-6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)转化成ω-3 PUFAs,提高了动物体内ω-3 PUFAs的含量。ω-3 PUFAs对人类的健康有重要作用,可以提高机体免疫力,预防多种心血管疾病等。本试验构建了由IRES介导的可同时表达Fat-1基因和标记基因EGFP的慢病毒载体。为后续转基因动物的生产奠定了基础。以往的慢病毒包装方法效率较低,且结果不稳定。为提高慢病毒包装效率,本试验研究比较了贴壁和悬浮293T细胞的磷酸钙法慢病毒包装效果。结果表明,利用悬浮细胞获得的病毒滴度较贴壁细胞高近3.5倍,同时,转染悬浮细胞的进行慢病毒包装具有很好的重复性,且悬浮细胞直接用于病毒包装,节省了至少24小时细胞培养时间。因此,本试验建立了悬浮细胞慢病毒高效包装技术。本试验研究了慢病毒与精子共孵育后体外受精制备转基因动物的方法。在小鼠和牛上重复多次均没有得到阳性胚胎。为了研究受精过程对慢病毒感染胚胎的影响,本试验采用卵周隙显微注射的方法,用低滴度的病毒(106 TU/ml)分别感染小鼠受精卵和卵母细胞。受精卵组的阳性率为8.3%,卵母细胞组没有得到阳性胚胎。此结果表明受精过程并没有明显提高慢病毒感染小鼠胚胎的效率。为了研究慢病毒载体在制备转基因牛上的应用,本试验分别取卵母细胞、受精卵、2~4细胞胚胎、8~16细胞胚胎、16细胞以上的桑葚胚,采用滴度为108 TU/ml的慢病毒进行透明带下显微注射。结果:受精卵组和2~4细胞胚胎组都没有得到阳性胚胎;卵母细胞组阳性率为33.3%;8~16细胞胚胎组阳性率为2.2%;桑葚胚组阳性率为71.4%。结果表明卵母细胞透明带下显微注射慢病毒来生产转基因牛是一种效率很高的方法。牛胚胎发育到8~16细胞后,随着基因组转录活性的增强,慢病毒感染效率越来越高。

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致谢 4-9缩略词表 9-10摘要 10-11ABSTRACT 11-13第一章：文献综述 13-18 1.1 慢病毒载体简介 13-14 1.2 慢病毒载体系统的发展历程 14-16 1.2.1 早期的慢病毒载体 14 1.2.2 慢病毒载体的系统化 14-16 1.3 慢病毒表达载体的构建策略 16 1.3.1 慢病毒载体的容量和特点 16 1.3.2 慢病毒载体的优化 16 1.3.3 可调控型载体的设计 16 1.3.4 双基因转移载体设计 16 1.4 慢病毒载体制备转基因动物 16-17 1.5 展望 17-18第二章表达sFat-1 基因慢病毒载体的构建及病毒包装 18-34 2.1 材料与方法 18-26 2.1.1 主要仪器 18 2.1.2 主要试剂 18-19 2.1.3 试剂的配制 19-20 2.1.4 慢病毒载体包装体系的建立 20-22 2.1.4.1 293T 细胞的培养 20 2.1.4.2 慢病毒质粒的准备 20-21 2.1.4.3 慢病毒的包装（磷酸钙转染法） 21 2.1.4.4 LaSRT 法测定病毒滴度 21-22 2.1.5 表达sFat-1 基因和 EGFP 基因双顺反子慢病毒载体的构建 22-24 2.1.5.1 sFat-1 基因的克隆 22-23 2.1.5.2 sFat-1 基因与慢病毒载体的连接 23 2.1.5.3 构建质粒的 PCR 检测 23-24 2.1.6 磷酸钙法与脂质体法包装慢病毒的对比 24-25 2.1.6.1 脂质体法转染293T 细胞 24 2.1.6.2 磷酸钙法转染293T 细胞 24-25 2.1.6.3 病毒滴度检测 25 2.1.7 贴壁和悬浮状态293T 细胞慢病毒包装效果的比较 25-26 2.1.7.1 转染试剂的配置 25 2.1.7.2 转染贴壁细胞 25 2.1.7.3 转染悬浮细胞 25-26 2.1.7.4 病毒滴度检测 26 2.2 结果及分析 26-32 2.2.1 慢病毒包装体系的建立 26 2.2.2 载体的构建 26-28 2.2.3 磷酸钙法与脂质体法包装慢病毒的对比 28-29 2.2.4 贴壁和悬浮状态293T 细胞慢病毒包装效果的比较 29-32 2.3 结论与讨论 32-34 2.3.1 慢病毒包装体系的建立 32 2.3.2 载体构建 32 2.3.3 磷酸钙法与脂质体法包装慢病毒的对比 32-33 2.3.4 贴壁和悬浮状态293T 细胞慢病毒包装效果的比较 33-34第三章利用慢病毒载体制备转基因小鼠胚胎 34-42 3.1 材料与方法 34-38 3.1.1 仪器设备 34 3.1.2 试验试剂 34 3.1.3 小鼠来源 34 3.1.4 试剂配制 34-36 3.1.5 小鼠体外受精 36 3.1.6 慢病毒感染精子 36-37 3.1.7 切割透明带[49] 37 3.1.8 卵母细胞透明带下显微注射慢病毒 37-38 3.1.9 受精卵透明带下显微注射慢病毒 38 3.2 结果与分析 38-40 3.2.1 慢病毒感染精子后体外受精 38 3.2.2 卵母细胞透明带的切割 38-39 3.2.3 透明带下注射慢病毒 39-40 3.3 结论与讨论 40-42第四章利用慢病毒载体制备转基因牛胚胎 42-53 4.1 材料与方法 42-46 4.1.1 仪器设备 42 4.1.2 试剂 42-43 4.1.3 牛卵巢来源 43 4.1.4 试剂的配制 43-44 4.1.5 卵母细胞的采集及体外成熟培养 44 4.1.6 精子的体外获能 44 4.1.7 体外受精 44-45 4.1.8 慢病毒感染精子 45 4.1.9 透明带下注射慢病毒 45-46 4.1.10 转基因胚胎的 PCR 检测 46 4.2 结果与分析 46-51 4.2.1 卵母细胞的成熟培养结果 46-47 4.2.2 慢病毒感染精子 47-48 4.2.3 透明带下注射慢病毒 48-51 4.2.4 转基因胚胎的 PCR 检测结果 51 4.3 结论与讨论 51-53 4.3.1 慢病毒感染精子 51 4.3.2 透明带下注射慢病毒 51-53第五章全文总结 53-54 5.1 表达sFat-1 基因慢病毒载体的构建 53 5.2 慢病毒的包装 53 5.3 不同方法制备小鼠和牛转基因胚胎效果的比较 53 5.4 切割透明带对小鼠体外受精效率的影响 53 5.5 受精过程对慢病毒感染小鼠胚胎效率的影响 53 5.6 透明带下注射法制备转基因牛胚胎 53-54参考文献 54-57

利用慢病毒载体制备转基因小鼠和牛胚胎的研究

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