学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

蟋蟀神经肽基因Grb-AST_3串联体的拼接与表达

作　者: 陈伟民
导　师: 黄俊生
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传与育种
关键词: 神经肽 Grb-AST3 串联体 pET 表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 31次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


Grb-AST3是从蟋蟀（Gryllus bimaculatus）脑中分离的一种咽侧体抑制素，体外实验显示它强烈抑制昆虫咽侧体合成保幼激素。这个多肽含有13个氨基酸残基，一级结构为N-GKRAGGRQYGFGL。蟋蟀AST基因共编码15个AST多肽，AST2是第3和第4个，其编码序列定名为Grb-AST3。本论文采用改进的PCR“自身模板-引物”法进行构建方法构建Grb-AST3串联体，并将拼接好的串联体转入大肠杆菌进行表达分析。 根据Grb-AST3和GKR（AST神经肽之间的连接序列）的编码序列设计合成两对引物。第一对中的一个引物，含有一个精氨酸稀有密码子，第二对引物则根据密码子的兼并性，所有碱基都置换成大肠杆菌偏爱的密码子。两对引物分别通过T4DNA Polymerase的拼接和高保真DNA聚合酶（PyrobestTM DNA Polymerase）的扩增来得到Grb-AST3多拷贝串联体。由于PyrobestTM DNA聚合酶扩增得到的PCR产物为平滑末端，因此选用pSK克隆载体上的EeoRV平末端酶切位点进行不定向克隆。从第一对引物的拼接产物中克隆到一个360bp含有9个拷贝数的Grb-AST3的串联体，从第二对引物的拼接产物中克隆到三个分别为515、750、792bp的Grb-AST3的串联体。 根据基因在克隆载体pSK上的插入方向，按照正确的阅读框，将Grb-AST3串联体基因分别克隆在大肠杆菌pET21b、pET22b、pET30a三个不同的表达载体上。测序表明读码框架正确后，将重组子分别转入表达宿主菌E.coli BL21（DE3）PlysS进行表达分析。通过诱导表达，结果，克隆在pET30a表达载体上的串联体基因Grb-A3C1、Grb-A3C3分别都表达出目的蛋白，且表达量约为6.8％和14.7％。而克隆在pET22b载体上的Grb-A38基因则表达量极低，表达量仅为0.8％。初步认为Grb-AST3串联体基因适宜采用融合表达载体表达。

全文目录


摘要  5-8
  1 中文摘要  5-6
  2 英文摘要  6-8
引言与文献综述  8-29
  1 生物技术在虫害控制上的应用  8-13
  2 昆虫神经肽的研究进展  13-16
  3 保幼激素抑制素的研究进展  16-19
  4 利用大肠杆菌获取重组蛋白的研究进展  19-21
  5 影响大肠杆菌中外源基因表达的因素  21-25
  6 基因串联体拼接的研究  25-26
  7 大肠杆菌PET表达系统  26-27
  8 本实验的研究目的和意义  27-28
  9 本实验的技术路线  28-29
材料与方法  29-42
  1 材料与试剂  29
    1.1 质粒与菌种  29
    1.2 试剂  29
    1.3 引物的合成与DNA测序  29
  2 Grb-AST_3串联体的拼接  29-35
    2.1 引物的设计与合成  29
    2.2 采用改进的“自身引物模板法”拼接Grb-AST_3串联体  29-35
      2.2.1 Grb-AST_3串联体的拼接  30-31
      2.2.2 Grb-AST_3串联体的回收  31
      2.2.3 Grb-AST_3串联体的克隆  31-34
      2.2.4 重组子的筛选与鉴定  34-35
      2.2.5 重组阳性克隆的保存  35
      2.2.6 重组子测序  35
  3 Grb-AST_3串联体的表达  35-42
    3.1 表达载体的构建  36-38
      3.1.1 表达载体的扩增  36
      3.1.2 表达载体线性化  36
      3.1.3 Grb-AST_3串联体的制备  36-37
      3.1.4 线性化载体与Grb-AST_3串联体的连接  37
      3.1.5 连接产物的转化  37-38
      3.1.6 重组子的筛选与鉴定  38
      3.1.7 阳性重组克隆的保存  38
      3.1.8 阳性重组克隆的保存  38
    3.2 Grb-AST_3串联体的表达  38-40
    3.3 表达产物的SDS-PAGE  40-42
结果与分析  42-46
  1 Grb-AST_3串联体的拼接  42-43
  2 PCR产物的克隆  43-44
  3 Grb-AST_3串联体的表达分析  44-46
    3.1 表达载体的构建  44-45
    3.2 表达分析  45-46
结论  46-47
讨论  47-50
  1 Grb-AST_3串联体的构建  47
  2 Grb-AST_3串联体的表达  47-50
参考文献  50-55
附图  55-63
致谢  63

相似论文

  1. 多转录因子组合调控研究,Q78
  2. 高校艺术教学建筑设计研究,TU244.3
  3. 时间表达式识别与归一化研究,TP391.1
  4. 拟南芥胱硫醚-γ-合成酶（D-AtCGS）基因在大肠杆菌中的表达及抗血清制备,Q943.2
  5. 红肉脐橙和‘国庆四号’温州蜜柑中CHS和CHI基因的克隆与表达及其对类黄酮积累的调控机制,S666.4
  6. 拟南芥热激因子HSFA1d响应甲醛胁迫的作用研究,Q945.78
  7. hBMP4和hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究,Q78
  8. 南极冰藻GPx、GST和SAHH基因的克隆、定量分析及原核表达载体的构建,Q943.2
  9. 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
  10. 草鱼呼肠孤病毒vp6和ns38基因的克隆、表达及VP6和NS38免疫原性研究,S941.41
  11. Pin1在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞周期的影响,R738.1
  12. 酮色林对炎性痛和神经病理性痛的治疗作用及其机制,R741
  13. BMP通路关键因子在人类牙胚组织中的表达检测,R78
  14. 《庄子》修辞策略探析,B223.5
  15. Gsα的过表达和缺失对果蝇大脑发育的影响,Q75
  16. 基于RNA测序技术的马氏珠母贝珍珠囊转录组及数字基因表达谱分析,Q786
  17. 磷酸化介导的UGT1A3代谢活性差异的初步研究,R346
  18. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  19. 稳定表达人有机阴离子转运多肽OATP1B1野生型及其突变体的HEK-293细胞系的构建,R96
  20. 论语文教师教学表达力,G633.3
  21. 条纹斑竹鲨和鲫鱼BAFF基因的克隆和性质分析,S917.4

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com