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抗菌肽Dermaseptin S4在杆状病毒表达系统中的表达与纯化

作　者: 张波
导　师: 韩跃武
学　校: 兰州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: Dermaseptin S4 6串联体杆状病毒表达系统基因表达蛋白纯化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达抗菌肽Dermaseptin S4 6串联体,并对其进行纯化和鉴定。为进一步研究抗菌肽Dermaseptin S4结构与功能的关系奠定基础。方法：1.根据抗菌肽Dermaseptin S4的氨基酸序列及真核生物偏爱密码子,推出Dermaseptin S4编码基因的序列,并将Dermaseptin S4基因通过连接肽(GATAGGTAGCG)将六个基因片段连接在一起,形成Dermaseptin S4 6串联体基因,并在六串联体的两侧分别加上了Xbal和SalⅠ的限制酶切位点,设计出目的基因,并通过化学合成方法将Dermaseptin S4 6串联体基因合成。2.将抗菌肽基因Dermaseptin S4六串联体克隆到BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFASTBac1载体中,构建了重组转座载体pFASTBac-6Dermaseptin S4,抽提重组质粒测序鉴定。3.将鉴定正确的重组质粒转化到DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经蓝白筛选,挑取阳性重组菌落,抽提重组质粒以通用引物RV作为引物进行PCR鉴定。4.获得重组成功的Bacmid DNA,并转染昆虫草地夜蛾(Bombyx mandafina)St9细胞出现病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾SD单层细胞,收集SD细胞培养上清和细胞再进行SDS-PAGE及Western blot5.用ProBondTM纯化系统(Invitrogen公司产品)采用非变性条件对抗菌肽Dermaseptin S4蛋白进行纯化。结果：1.重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明成功构建了pFASTBac-6Dermaseptin S4质粒。2.12%聚丙烯酰胺凝胶电泳可见表达的目的蛋白带,分子量大小为27000，与理论值相符,灰度扫描显示,表达量约占细胞总蛋白的20.1%.Western blot显示目的蛋白均具有良好的反应原性。结论：成功构建了抗菌肽Dermaseptin S4 6串联体,并在昆虫细胞中经杆状病毒表达系统得到成功表达,并进一步对目的蛋白进行了纯化,为下一步蛋白结构与功能的关系奠定基础。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-7
第一部分前言  7-25
  第一章抗菌肽的概述  7-13
  第二章抗菌肽及抗菌肽DS4的研究进展  13-24
  第三章本课题的选题意义及特色  24-25
第二部分研究内容  25-54
  第一章实验材料  25-34
  第二章实验方法  34-49
  第三章实验结果  49-54
讨论  54-57
结论  57-58
参考文献  58-61
研究生在读期间发表的论文  61-62
致谢  62

抗菌肽Dermaseptin S4在杆状病毒表达系统中的表达与纯化

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