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力达霉素产生菌中atrA同源基因的克隆及其功能的初步研究

作　者: 李光伟
导　师: 洪斌；李元；石莲英
学　校: 北京协和医学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 力达霉素 atrA 同源基因生物合成基因簇硫链丝菌素质粒天蓝色链霉菌片段产生菌表达蛋白阿维链霉菌异源表达突变菌株接合转移北京协和医学院同源重组双交换基因组球孢链霉菌灰色链霉菌
分类号: TQ465
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

力达霉素(lidamycin)是一种新型的烯二炔类抗肿瘤抗生素,又名C-1027,由球孢链霉菌C-1027 (S. globisporus C-1027)产生。其分子由一个酸性辅基蛋白和一个烯二炔结构的发色团非共价结合组成。力达霉素生物合成基因簇已被克隆,其中至少存在sgcR1、sgcR2、sgcR3、sgcR、sgcM五个基因为可能的调控基因。但是,在力达霉素生物合成基因簇外尚未发现调控力达霉素生物合成的基因。2005年,人们首先在天蓝色链霉菌基因组中发现atrA基因(atrA-c),它位于四种已知抗生素生物合成基因簇的外部,其表达蛋白AtrA能够特异性调控actll-orf4的转录,使放线紫红素的产量升高。此后,人们陆续在灰色链霉菌和阿维链霉菌中也发现了atrA的同源基因,均位于抗生素生物合成基因簇之外,并且分别对链霉素和阿维菌素的生物合成有正调控和负调控作用。以上这些研究激发了我们从力达霉素产生菌S. globisporusC-1027基因组中寻找atrA同源基因的兴趣。本工作首先在球孢链霉菌C-1027中异源表达天蓝色链霉菌的AtrA蛋白(AtrA-c),结果显示AtrA-c可能对力达霉素的生物合成起调控作用。然后,通过PCR扩增得到了球孢链霉菌C-1027 atrA的全序列以及该基因上下游的旁侧序列。同源性分析显示,C-1027 AtrA蛋白与天蓝色链霉菌AtrA蛋白在286个氨基酸范围内一致性为65%,相似性为70%；与灰色链霉菌AtrA蛋白在269个氨基酸范围内的一致性为87%,相似性为89%；与阿维链霉菌AtrA蛋白在256个氨基酸范围内的一致性为71%,相似性为78%。为了研究atrA在体内的生物学功能,本实验采用同源重组双交换的方法将atrA基因阻断。根据atrA全序列以及该基因上下游的旁侧序列,PCR扩增了用于阻断atrA的前臂atrAAB和后臂atrACD。然后以携带阿普霉素抗性基因的温敏型质粒pKC1139为载体,构建了阻断atrA的阻断质粒pKC-atrAAt1c。该质粒包含atrA基因上游和下游两侧的片段,并在两片段中间插入硫链丝菌素抗性基因片段(tsr)作为筛选标记。将重组质粒通过接合转移的方法从大肠杆菌E. coli ET12567/pUZ8002转移至S. globisporus C-1027。通过温度和抗性双重筛选得到了具有硫链丝菌素抗性(Thior)而对阿普霉素敏感(Ams)的接合子,为可能发生了同源双交换的接合子。利用PCR和Southern blot的方法对其进行验证,最终获得了发生同源双交换的突变株。将atrA阻断的突变菌株命名为S. globisporus atrAKO。对野生株、阻断株进行生物活性测定,结果表明阻断株S. globisporus atrAKO产生的抑菌圈在96 hr、120 hr和144 hr均明显小于S. globisporus C-1027产生的抑菌圈。以上结果初步证明了atrA在球孢链霉菌C-1027中对力达霉素的生物合成具有正调控作用。

全文目录

目录  3-4
缩略语一览表  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-11
材料与方法  11-27
结果与讨论  27-58
结论  58-59
论文参考文献  59-61
文献综述  61-79
  综述参考文献  75-79
附录  79-84
致谢  84-85

力达霉素产生菌中atrA同源基因的克隆及其功能的初步研究

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