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植物乳杆菌C88胞外多糖的结构分析及生物合成基因的克隆

作　者: 戴大海
导　师: 杨贞耐
学　校: 东北师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 乳酸菌 植物乳杆菌 胞外多糖 生物合成 基因簇
分类号: TS201.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


乳酸菌胞外多糖对改善发酵乳制品的理化性质至关重要。它被公认为是食用安全性的天然增稠剂,能显著改善发酵乳制品的粘性、质地和口感等,具有广阔的应用前景。为了进一步了解乳酸菌胞外多糖的结构与功能的关系及更好的调控胞外多糖的生物合成,本研究对一株分离自内蒙古传统发酵乳制品的植物乳杆菌C88胞外多糖进行了分离纯化和结构分析,并对胞外多糖生物合成基因进行了克隆、鉴定和生物信息学分析。研究结果如下:通过基于负染法的乳酸菌荚膜多糖快速染色镜检技术及改进的荚膜多糖透射电镜分析方法,观察了植物乳杆菌C88产荚膜多糖。通过绘制发酵曲线和多糖含量测定,证明了植物乳杆菌C88为同时产黏液多糖和荚膜多糖的菌株。采用乙醇沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱层析和Sepharose CL-6B分子筛层析法从植物乳杆菌C88半合成培养基(Semi-defined medium, SDM)中分离纯化得到一种均一组分的胞外多糖。采用离子色谱和红外光谱法对其单糖组成和结构进行初步分析,结果表明,植物乳杆菌C88胞外多糖主要由半乳糖和葡萄糖两种单糖组成,其物质的量比为1:2。凝胶过滤层析法分析了胞外多糖的分子量为1.15×106Da。并对植物乳杆菌C88胞外多糖进行化学修饰,获得了其硫酸化和磷酸化衍生物。根据已经报道的乳酸菌胞外多糖合成相关基因的保守性和同源性,选择调控胞外多糖生物合成关键酶基因的保守区域,设计PCR引物,扩增了植物乳杆菌C88磷蛋白磷酸酶基因(wzb)和CPS4A基因序列。并通过染色体步移的方法,克隆了CPS4A上游4.9kb的保守区域,获得了非特异性蛋白-酪氨酸激酶(CPS4B)、磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(CPS4C)、引导糖基转移酶(CPS4E)和UDP-葡萄糖4-差向异构酶(galE3)基因序列。使用NCBI blast在线搜索和比对法将该序列与其它已报道乳酸菌胞外多糖生物合成基因簇比较具高度同源性和保守性,并对基因可读框(ORFs)进行了结构和功能的预测分析。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章 前言  8-19
  1 乳酸菌胞外多糖的结构及生物功能  8-13
    1.1 乳酸菌胞外多糖的分类  8-12
    1.2 乳酸菌胞外多糖的生物功能  12
    1.3 乳酸菌胞外多糖的应用  12-13
  2 乳酸菌胞外多糖生物合成基因簇  13-14
  3 乳酸菌胞外多糖的生物合成  14-17
    3.1 糖转输入胞质  14
    3.2 合成糖-1-磷酸  14-15
    3.3 糖核苷酸合成及胞外多糖重复单位的聚合  15
    3.4 胞外多糖的合成及输出  15-17
  4 选题依据、目的和意义  17-19
第二章 植物乳杆菌C88 胞外多糖的分离纯化和结构分析  19-34
  1 实验药品和仪器  19-20
    1.1 实验药品  19
    1.2 实验仪器  19-20
  2 材料与方法  20-25
    2.1 乳杆菌的分离和鉴定  20
    2.2 菌株和培养条件  20-21
    2.3 培养基  21
    2.4 观察荚膜  21
    2.5 多糖含量测定  21-22
    2.6 发酵曲线  22
    2.7 胞外多糖的分离  22-23
    2.8 胞外多糖的纯化  23-24
    2.9 胞外多糖的结构分析  24-25
    2.10 胞外多糖的结构修饰  25
  3 实验结果  25-32
    3.1 乳杆菌的分离鉴定  25-26
    3.2 观察荚膜  26-27
    3.3 生长曲线及胞外多糖产生  27-28
    3.4 胞外多糖的分离纯化  28-29
    3.5 胞外多糖结构分析  29-31
    3.6 胞外多糖的结构修饰  31-32
  4 讨论  32-34
第三章 植物乳杆菌C88 胞外多糖生物合成基因的克隆和分析  34-49
  1 实验材料和仪器  34-35
    1.1 菌株和引物  34
    1.2 培养基  34
    1.3 实验药品和试剂盒  34-35
    1.4 主要仪器设备  35
  2 实验方法  35-39
    2.1 菌种的保存和培养  35
    2.2 基因组DNA 的提取  35-36
    2.3 DNA 电泳及DNA 片断的回收和纯化  36
    2.4 JM109 感受态细胞的制备和DNA 转化  36-37
    2.5 胞外多糖生物合成基因的克隆  37
    2.6 染色体步移  37-39
  3 实验结果  39-47
    3.1 基因组DNA 的提取  39
    3.2 磷蛋白磷酸酶基因的克隆及测序  39-40
    3.3 UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的克隆及测序  40-42
    3.4 染色体步移和生物信息学分析  42-47
  4 讨论  47-49
结论  49-50
参考文献  50-56
致谢  56

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品微生物学
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