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灰色链霉菌RX-17溶菌酶基因文库的构建及筛选

作　者: 张晓东
导　师: 张玉臻
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 灰色链霉菌基因文库重组转化基因扩增
分类号: Q785
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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引　用: 2次
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内容摘要

灰色链霉菌(Streptomyces griseus)RX-17所产的溶菌酶系,不仅具有β-1,4-N-乙酰胞壁质酶活力,还具有β-1,4-N,6-0-二乙酰胞壁质酶活力。前期研究发现本菌株产生溶菌酶含有多个组分,R1、R2和R3,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及变形链球菌(Streptococcus mutans Ingbritt)有溶解作用。本文采用随机鸟枪法构建基因文库,筛选溶菌酶基因,为今后溶菌酶基因组的研究奠定基础。限制性内切酶Sau3AI对灰色链霉菌(S.griseus)RX-17基因组DNA进行不完全酶切,回收2-10kb的DNA片段:回收片段与经BamHI酶切、CIAP去磷酸化处理后的pUC19连接,构建重组质粒,转化E.coli DH5 α感受态细胞;通过Amp抗性及α互补原理进行初筛,构建基因文库。灰色链霉菌(S.griseus)溶菌酶对变形链球菌(S.mutans Ingbritt)有着显著的溶解作用,因此我们用变形链球菌(S.mutans Ingbritt)作底物用酶活测定的方法对文库进行筛选。25℃低温诱导对文库进行筛选,得到两株具有酶活的重组子。破碎细胞,20号重组菌株上清液SDS-PAGE电泳检测到24kD的重组蛋白,大小与溶菌酶组份R2相同;以primerA、primerB为引物PCR扩增,在有酶活的20号重组菌株扩增出一段大小为700kb左右的PCR片段,与溶菌酶R2基因片段大小接近;证实了在随机文库中筛选到R2基因。对于重组子的筛选还可以采用PCR检测的方法。根据共用引物和R1N末端设计的引物扩增到大小约1.3kb左右基因片段。

全文目录

目录  4-8
中文摘要  8-9
Abstract  9-10
第一章前言  10-28
  1. 溶菌酶的理化性质  10-16
    1.1 溶菌酶的分型  11
    1.2 溶菌酶的溶菌谱  11-12
    1.3 溶菌酶的分布  12-13
      1.3.1 动物溶菌酶  12
      1.3.2 植物溶菌酶  12-13
      1.3.3 微生物溶菌酶  13
    1.4 溶菌酶的结构  13-15
    1.5 溶菌酶的催化机制  15-16
  2 溶菌酶的应用  16-19
    2.1 溶菌酶在食品工业中的应用  16-17
      2.1.1 食品防腐剂  16-17
      2.1.2 食品保鲜剂  17
    2.2 溶菌酶营养、保健功能的应用  17-18
    2.3 溶菌酶在医药方面的应用  18-19
    2.4 溶菌酶在农业上的应用  19
  3 溶菌酶的应用前景  19-20
  4 溶菌酶的分子生物学研究  20-23
  5 关于基因文库的构建  23-24
  6 大肠杆菌中的包涵体  24-25
    6.1 包涵体的形成和性质  24
    6.2 减少包涵体形成的策略  24-25
      6.2.1 降低重组菌的生长温度  24-25
      6.2.2 促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂  25
  7 本课题立题依据及前景分析  25-26
  8 本课题研究的主要内容、目的、意义  26-28
    8.1 研究内容  26
    8.2 研究目的  26-27
    8.3 研究意义  27-28
第二章灰色链霉菌RX-17溶菌酶基因文库的构建  28-44
  2.1 材料和设备  28-30
    2.1.1 菌株和质粒  28
    2.1.2 培养基  28
    2.1.3 工具酶及主要试剂  28-29
    2.1.4 主要仪器设备  29-30
  2.2 方法  30-36
    2.2.1 灰色链霉菌的菌体纯化培养  30
    2.2.2 链霉菌染色体DNA的提取  30-31
    2.2.3 基因组DNA的酶切试验  31-33
    2.2.4 琼脂糖凝胶电泳技术  33
    2.2.5 大量DNA的部分酶切  33
    2.2.6 克隆载体PUC19 DNA的制备  33-34
    2.2.7 BamH Ⅰ单酶切pUC19质粒  34
    2.2.8 连接反应  34
    2.2.9 CaCl_2法转化大肠杆菌  34-35
      2.2.9.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  34-35
      2.2.9.2 转化反应  35
    2.2.10 重组质粒的筛选  35
    2.2.11 转化质粒的提取  35
    2.2.12 菌种保藏技术  35-36
  2.3 结果与讨论  36-43
    2.3.1 总DNA提取检测  36-37
    2.3.2 总DNA紫外检测  37
    2.3.3 总DNA的限制性酶切验证  37-38
    2.3.4 小量酶切检测部分降解的反应条件  38
    2.3.5 低琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA及检测  38-39
    2.3.6 碱裂解法提取质粒纯度检测  39
    2.3.7 酶切后质粒检测及切胶回收  39-40
    2.3.8 CIAP末端去磷酸化与连接  40
    2.3.9 重组子的筛选策略  40-42
    2.3.10 基因文库的扩增  42
    2.3.11 重组质粒的保存  42-43
  2.4 小结  43-44
第三章灰色链霉菌RX-17溶菌酶基因文库的筛选  44-55
  3.1 材料和设备  44-45
    3.1.1 材料  44-45
      3.1.1.1 菌株和质粒  44
      3.1.1.2 培养基  44-45
      3.1.1.3 工具酶及生化试剂  45
  3.2 方法  45-47
    3.2.1 重组子菌体的低温诱导培养  45-46
    3.2.2 重组子菌体细胞的破碎  46
    3.2.3 重组子菌体细胞破碎液的酶活力测定  46
    3.2.4 SDS-PAGE分析  46
    3.2.5 重组质粒pUC19-R的提取  46
    3.2.6 限制性酶切鉴定重组质粒  46-47
    3.2.7 重组质粒的PCR分析  47
    3.2.8 重组子的PCR检测  47
  3.3 结果与讨论  47-52
    3.3.1 重组子质粒的物理图谱  47-48
    3.3.2 重组子在大肠杆菌中表达  48-50
      3.3.2.1 胞内酶活测定  48-49
      3.3.2.2 胞外酶活测定  49-50
      3.3.2.3 20号菌沸水浴前后酶活比较  50
    3.3.3 诱导表达产物鉴定  50-51
    3.3.4 重组子质粒的验证  51-52
    3.3.5 重组子的PCR检测  52
  3.4 小结  52-53
  3.5 展望  53-55
总结  55-56
参考文献  56-61
致谢  61

灰色链霉菌RX-17溶菌酶基因文库的构建及筛选

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