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抗天牛基因（cry3Aa同源基因）的克隆、改造及其对杨树的转化

作　者: 陈军
导　师: 刘友全；卢孟柱
学　校: 中南林学院
专　业: 林木遗传育种
关键词: 苏云金芽胞杆菌 cry3Aa同源基因的克隆和表达 基因人工改造 转基因杨树 抗天牛
分类号: Q943
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要


本文通过对中国林业科学研究院林业研究所生物技术室所分离、筛选的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株Bt886进行的深入研究，初步确认了该菌株所属的类型，然后深入到分子水平做出了验证。以该菌株为材料，克隆出了对光肩星天牛(Anoplophra labripennis (Motsch.))具有毒杀作用的cry3Aa同源基因，并且对该基因进行了人工改造、人工合成、大肠杆菌表达、生物活性测定、双元表达载体的构建以及对杨树的转化等一系列研究，主要结果如下： (1)显微观察该菌株所形成的伴孢晶体为方形。生物活性测定结果表明该菌株对榆蓝叶甲(Pyrrhalta aenescens (Fairmaire))和光肩星天牛等鞘翅目昆虫具有较高的毒力，因此初步确认该菌株属于cry3类； (2)发现该菌株中编码毒蛋白的基因位于质粒上，并且已经成功地克隆到该基因。经测序表明，该cry3Aa同源基因全长1956bp，GC含量较低，为35.95％，与cry3Aa1的序列同源性极高，仅有6个碱基和2个氨基酸的差异； (3)苏云金芽孢杆菌来源的cry3Aa同源基因与真核来源的杨树基因相比，发现它们对各种氨基酸的同义三联体密码子的偏好和使用频率存住着很大的差异，这可能正是原核来源的基因在真核生物中表达效率低的主要原因之一。通过对氨基酸密码子的偏好、使用频率、多聚腺苷酸信号序列(PPSS)、mRNA不稳定序列(DST)以及Kozak等结构的优化改造，人工设计、合成了预期能在杨树中高效表达的毒蛋白基因Modified cry3Aa同源基因； (4)利用强启动子表达载体pET30-b完成了cry3Aa同源基因在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE电泳表明，在大肠杆菌中所表达的融合蛋白位于66kDa～97kDa之间； (5)大肠杆菌表达产物生物测定表明：苏云金芽孢杆菌菌株Bt886对鞘翅目昆虫的高毒力主要归因于菌体内位于质粒上的cry3Aa同源基因。因此，所克隆的cry3Aa同源基因完全可以用于培育抗天牛的植物新品种； (6)获得了重组双元植物表达载体pBin438-Mcry3和pBI121-2k，为进一步转化杨树及其它植物品种，培育抗天牛的植物新品种奠定了良好的基础； 中南林学院硕士研究生毕业论文2003 （7）建立了两套完整的杨树转化体系，一套为农杆菌介导的外源基因转化体系，一套为花粉管通道法转化体系； （）获得了一批抗恃那霉素的，导入了外源基因 err3Aa同源基因和 Modified err3Aa同源基因的杨树幼茁，目前正在进行检测筛选。

全文目录


摘要  5-7
1 文献综述  7-21
  1.1 我国天牛的危害现状及防治措施  7-8
    1.1.1 我国天牛危害现状  7
    1.1.2 不同时期的天牛防治措施  7-8
  1.2 基因工程在虫害防治中的应用  8-10
  1.3 苏云金芽孢杆菌研究进展  10-19
    1.3.1 苏云金芽孢杆菌及Bt毒蛋白基因的分类  11-13
    1.3.2 苏云金芽孢杆菌毒蛋白的结构  13-15
    1.3.3 苏云金芽孢杆菌毒蛋白的毒理研究  15-17
    1.3.4 对苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因的改造  17-18
    1.3.5 利用Bt.基因防治害虫潜在的问题、解决途径以及研究展望  18-19
  1.4 本课题研究的目的及意义  19-20
  1.5 本课题研究的技术路线  20-21
2 cry3Aa同源基因的克隆及序列分析  21-34
  2.1 材料、仪器与方法  21-25
    2.1.1 材料  21-22
    2.1.2 仪器设备  22
    2.1.3 方法  22-25
  2.2 结果与分析  25-32
    2.2.1 cry3Aa同源基因的克隆  25-27
    2.2.2 cry3Aa同源基因序列分析  27-32
  2.3 讨论与小结  32-34
3 cry3Aa同源基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的活性分析  34-42
  3.1 材料、仪器与方法  34-37
    3.1.1 实验材料  34-35
    3.1.2 仪器设备  35-36
    3.1.3 研究方法  36-37
  3.2 结果与分析  37-41
    3.2.1 原核表达载体pET30b-2k的构建  37-38
    3.2.2 融合基因在大肠杆菌中的诱导表达  38-39
    3.2.3 大肠杆菌总蛋白的提取与检测  39
    3.2.4 表达产物的生物活性测定  39-41
  3.3 讨论  41-42
4 cry3Aa同源基因的改造及载体构建  42-52
  4.1 材料、仪器与方法  42-44
    4.1.1 实验材料  42-43
    4.1.2 仪器设备  43
    4.1.3 研究方法  43-44
  4.2 结果与分析  44-51
    4.2.1 Modified cry3Aa同源基因的设计  44-46
    4.2.2 Modified cry3Aa同源基因的合成与检测  46-47
    4.2.3 植物表达载体pBin438-Mcry3的构建  47-49
    4.2.4 植物表达载休pBI121-2k的构建  49-51
  4.3 讨论  51-52
5 重组质粒对杨树的转化  52-56
  5.1 材料、设备与方法  52-54
    5.1.1 实验材料  52
    5.1.2 仪器设备  52-53
    5.1.3 研究方法  53-54
  5.2 结果与分析  54-55
    5.2.1 pBI121-2k转化农杆菌LBA4404  54
    5.2.2 pBI121-2k转化杨树  54-55
    5.2.3 pBin438-Mcry3转化杨树  55
  5.3 讨论与小结  55-56
6 结论  56-57
参考文献  57-63
ABSTRACT  63-64
致谢  64

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学
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