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灰色链霉菌ATCC14811胆固醇氧化酶基因的分子生物学研究

作　者: 周礼芹
导　师: 张启发；邓子新
学　校: 华中农业大学
专　业: 分子生物学
关键词: 灰色链霉菌胆固醇氧化酶克隆序列分析
分类号: Q933
类　型: 博士论文
年　份: 1999年
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内容摘要

胆固醇氧化酶是胆固醇代谢的关键酶之一，它催化胆固醇氧化及异构反应，生成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢。胆固醇氧化酶被广泛应用于临床各种样本胆固醇含量测定、制药工业及食品加工等方面。本实验设计了简单易行的链霉菌胆固醇氧化酶活性测定指示平板，结合用链霉菌SA-COO(Streptomyces sp.strain SA-COO)胆固醇氧化酶基因(choA)为异源探针的Southern杂交，确证了灰色链霉菌ATCC14811(Streptomyces griseus ATCC14811)具备产生胆固醇氧化酶的能力。为了获得胆固醇氧化酶基因，以大肠杆菌-链霉菌双功能柯斯质粒pHZ1357为载体，构建了灰色链霉菌ATCC14811的基因组文库。通过以choA为探针的原位杂交，获得了两个阳性重组子4D3(pHZ1140)和20D2(pHZ1141)。pHZ1140和pHZ1141向变铅青链霉菌的导入赋予了寄主产生胆固醇氧化酶特性。对pHZ1140和pHZ1141进行BamHⅠ及BglⅡ的酶谱分析及与choA探针的杂交，将胆同醇氧化酶基因初步定位在8.8kbBamHⅠ和9.9kb BglⅡ片段上。回收8.8kbBamHⅠ片段与经BglⅡ线性化的大肠杆菌-链霉菌双功能质粒plJ653连接，构建了质粒pHZ1148。其后的亚克隆和功能试验将胆固醇氧化酶基因定位在pHZ1148的2.3kbEcoRI-SalⅠ片段上，将该片段克隆到大肠杆菌载体pBluescript ⅡSK(+)上，形成质粒pHZ1754。在pHZ1754中载体上单一的BamHⅠ位点上插入包含链霉菌质粒pSG5的复制子和硫链丝菌素抗性基因tsr的4.3kbBglⅡ片段，所获得的质粒pHZ1755具有完整的胆固醇氧化酶基因活性。将该基因命名为choG。对pHZ1754进行外切核酸酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ，ExoⅢ)顺序缺失，获得单向长度渐减重叠的系列突变体，核苷酸序列测定显示出该EcoRⅠ-SalⅠ片段的精确大小为2299bps，Frame Plot程序分析揭示出该区域一个完整的开放阅读框(ORF)的存在，其大小为1656bps，G+C含量为70.3％，编码552个氨基酸，利用Blast Search程序将ORF的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与因特网上基因及蛋白质数据库进行综合比较，发现无论在核苷酸水平还是在蛋白水平上，该ORF均与胆固醇氧化酶表现出同源性，而且与链霉菌胆固醇氧化酶同源性最高，说明该ORF编码胆固醇氧化酶基因。choG与choA核苷酸同源性为85％，氨基酸水平上ChoG和ChoA存在77％同一性和87％的相似性。ChoG与ChoB(Brevibacterium sterolicum)的氨基酸同一性和相似性分别为53％和70％，根据推导的氨基酸序列ChoG蛋白质前体的分子量为60020，ChoG N端区域显示信号肽特征。对胆固醇氧化酶的酶学及物理化学性质进行了初步探索。利用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素离子交换柱层析提取纯化灰色链霉菌ATCC14811发酵上清液中的胆固醇氧化酶，理化性质研究表明酶作用晟适pH为8.0，最适温度为45℃，pH稳定范围在pH4.0-11.5之间，在50℃条件下保温4h，仍保留54％酶活力。本项研究完成了对灰色链霉菌ATCC14811胆固醇氧化酶基因的克隆、序列测定及酶学性质研究等方面的工作。为进一步的蛋白工程设计以及实际生产应用提供了理论基础。

全文目录

目录  3-5
中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
缩略语  8-10
1 文献综述  10-33
  1.1 放线菌简介  10-11
    1.1.1 放线菌及其产生的酶  10-11
    1.1.2 链霉菌作为主要工业微生物的特点  11
  1.2 胆固醇氧化酶概论  11-17
    1.2.1 胆固醇氧化酶的研究历史  11-12
    1.2.2 胆固醇氧化酶一般性质  12-15
    1.2.3 胆固醇氧化酶的分离纯化  15-16
    1.2.4 胆固醇氧化酶的活力测定  16-17
    1.2.5 胆固醇氧化酶的生物学功能  17
  1.3 胆固醇氧化酶的结构及催化机理  17-25
    1.3.1 胆固醇氧化酶的结构  17-20
    1.3.2 胆固醇氧化酶的催化作用机理  20-24
    1.3.3 底物与一性  24
    1.3.4 抑制剂  24-25
  1.4 胆固醇氧化酶的应用  25-28
    1.4.1 临床诊断  25-27
    1.4.2 食品加工  27
    1.4.3 制药工业  27
    1.4.4 工具酶  27
    1.4.5 潜在应用  27-28
  1.5 胆固醇氧化酶的遗传改良  28-32
    1.5.1 基因工程改良  28
    1.5.2 蛋白质工程改良  28-29
    1.5.3 DNA Shuffling  29-32
  1.6 本研究的立论基础与目的  32-33
2 材料与方法  33-47
  2.1 实验用菌株  33-34
  2.2 实验用质粒  34-35
  2.3 实验方法  35-47
3 结果与分析  47-102
  3.1 胆固醇氧化酶产生菌的筛选  47-54
    3.1.1 降解胆固醇菌株的检测  48
    3.1.2 胆固醇氧化酶产生菌的确证  48-49
    3.1.3 灰色链霉菌ATCC14811总DNA与异源探针choA的杂交  49-52
    3.1.4 小结  52-54
  3.2 灰色链霉菌ATCC14811基因组文库的构建及胆固醇氧化酶基因的克隆  54-78
    3.2.1 灰色链霉菌ATCC14811基因组文库的构建  54-58
    3.2.2 ATCC14811基因组文库质量分析  58
    3.2.3 含胆固醇氧化酶基因重组子的获得  58-61
    3.2.4 胆固醇氧化酶基因的亚克隆、定位及酶谱制作  61-74
    3.2.5 含胆固醇氧化酶基因的DNA片段的来源验证  74
    3.2.6 小结  74-78
  3.3 胆固醇氧化酶基因核苷酸序列测定及分析  78-95
    3.3.1 测序用载体  78-80
    3.3.2 外切核酸酶Ⅲ缺失突变体的获得  80-81
    3.3.3 序列测定  81-82
    3.3.4 序列编辑与序列分析  82-94
    3.3.5 小结  94-95
  3.4 胆固醇氧化酶的纯化及其性质  95-102
    3.4.1 酶的提纯  95-96
    3.4.2 酶反应初速度  96
    3.4.3 pH对胆固醇氧化酶的影响  96-98
    3.4.4 温度对胆固醇氧化酶的影响  98
    3.4.5 胆固醇氧化酶的酸碱稳定性  98
    3.4.6 胆固醇氧化酶热稳定性  98-100
    3.4.7 酶产量与细胞生长曲线  100
    3.4.8 不同产酶培养基产酶量的比较  100
    3.4.9 小结  100-102
4 总结与讨论  102-105
  4.1 总结  102-103
  4.2 讨论  103-105
    4.2.1 choG基因异源宿主中表达  103
    4.2.2 菌种改良及胆固醇氧化酶功能的改良  103-104
    4.2.3 酶学性质研究  104
    4.2.4 灰色链霉菌ATCC14811其它生物学功能的研究  104-105
参考文献  105-112
致谢  112

灰色链霉菌ATCC14811胆固醇氧化酶基因的分子生物学研究

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