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新型抗肿瘤抗生素力达霉素生物合成调控基因sgcR和sgcM的功能研究

作　者: 马迪
导　师: 洪斌
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 医科大学生物合成硫链丝菌素突变株遗传互补双交换调控基因灰色链霉菌接合转移协和
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

力达霉素(lidamycin)是一种新型的烯二炔类抗肿瘤抗生素，又叫C-1027，由球孢链霉菌C-1027(S.globisporus C-1027)产生。其分子由一个酸性辅基蛋白和一个烯二炔结构的发色团非共价结合组成。力达霉素生物合成基因簇已被克隆，其中一些结构基因的功能已经阐明，并由此推测了力达霉素的主要生物合成步骤。在力达霉素生物合成基因簇中有一些功能尚未明确的基因，通过生物信息学的分析推测其中某些基因可能为力达霉素生物合成中的调控基因。其中，sgcR基因全长1，148 bp，位于力达霉素生物合成基因簇序列中54，226-55，374 bp。氨基酸序列比对分析表明，SgcR与一个属于XRE(Xenobiotic Response Element，XRE)家族的DNA结合蛋白具有一定的相似性，XRE家族蛋白是一类具有典型HTH结构域的转录调控蛋白；sgcM基因全长1，040 bp，位于力达霉素生物合成基因簇序列中50，345-51，385 bp。氨基酸序列比对分析表明，SgcM与Streptomyces carzinostaticus新制癌菌素生物合成基因簇ORF14编码的蛋白高度同源。此外，SgcM还与S.coelicolor A3(2)中的一个DNA结合蛋白有一定同源性，该蛋白具有可以结合DNA的HTH基序。为了研究sgcR和sgcM在体内的生物学功能，本实验采用同源重组双交换的方法分别将sgcR和sgcM基因阻断。在基因中断实验中，利用pKC1139和pOJ260载体分别构建了两种阻断质粒。阻断质粒包含所要阻断目的基因上游和下游两侧的约1 kb片段，并在两片段中间插入硫链丝菌素抗性基因片段(tsr)作为筛选标记。将重组质粒通过接合转移的方法从大肠杆菌E.coli ET12567／pUZ8002转移至S.globisporus C-1027。通过抗性筛选得到了具有硫链丝菌素抗性(Thio~r)而阿普霉素敏感(Am~s)的接合子，得到可能发生了同源双交换的接合子。利用PCR和Southern Blot的方法对其进行验证，最终获得了发生同源双交换的sgcR和sgcM阻断突变株。sgcR突变株命名为S.globisporus RKO，在其基因组上，sgcR内部大部分片段被tsr取代；sgcM突变株命名为S.globisporus MKO，在其基因组上，sgcM内部大部分片段被tsr取代。分别以pSET152和pKC1139作为回复载体，将带有强启动子ermE~*p的sgcR分别克隆至两种载体的多克隆位点，导入阻断株中进行遗传互补。经过抗性筛选以及验证后得到sgcR的互补菌株。对阻断和回复突变株进行发酵后，取发酵液进行生物检定，结果显示在阻断突变株S.globisporus RKO中力达霉素产量提高，而互补菌株中力达霉素的产生与阻断株相比明显被抑制。根据以上结果推断SgcR可能为力达霉素生物合成过程中的一个重要负调控因子。分别以pSET152和pKC1139作为回复载体，将带有强启动子ermE~*p的sgcM分别克隆至两种载体的多克隆位点，导入阻断株中进行遗传互补。经过抗性筛选以及验证后得到sgcM的互补菌株。对阻断和回复突变株进行发酵后，取发酵液进行生物检定，结果显示在阻断突变株S.globisporus MKO中力达霉素的产量没有明显的变化，而互补菌株中力达霉素的产生明显被抑制。根据以上结果推断SgcM可能为力达霉素生物合成过程中的一个负调控蛋白。由于某些未知的原因，该蛋白的缺失并不影响力达霉素的生物合成，然而SgcM的过量表达则显著抑制力达霉素的产生。

全文目录

缩略语一览表  4-5
文献综述  5-17
中文摘要  17-19
英文摘要  19-21
前言  21-23
材料与方法  23-39
结果与讨论  39-65
结论  65-66
参考文献  66-74
附图  74-84
致谢  84

新型抗肿瘤抗生素力达霉素生物合成调控基因sgcR和sgcM的功能研究

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