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应用基因组改组技术选育真菌α-淀粉酶高产菌株

作　者: 刘源慧
导　师: 郑毅
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: α-淀粉酶 米曲霉 诱变 基因组改组 发酵优化
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


以实验室保藏的米曲霉FS-16为原始出发菌株,通过传统诱变方法构建正突变库。通过致死曲线的测定,确定紫外诱变照射剂量为160s,微波诱变辐射剂量为25s。出发菌株分别经紫外诱变、微波诱变,采用淀粉平板透明圈初筛、液体发酵复筛,最终从2000多个突变株中筛选到α-淀粉酶产量较高稳定性较好的突变株FU-8、FU-26、FW-111及FW-130。通过单因素实验获得米曲霉原生质体制备和再生的最佳条件：菌龄15h,酶解温度28℃、裂解时间2.5h、0.6mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,含0.6mol/L NaCl的PDA培养基为再生培养基。通过响应面分析法对破壁酶系统进行研究,获得最佳酶系组成为：蜗牛酶0.8%、纤维素酶0.8%、溶菌酶0.5%。通过米曲霉原生质体灭活实验得出,用紫外线处理180S或热处理12min,米曲霉原生质体即可达到100%灭活；原生质体融合条件研究表明最适融合条件为：PEG30%,Ca2+0.02mol/L,融合时间10min,融合温度30℃。以原始菌株FS-16和诱变筛选出的突变株FU-8、FU-26、FW-111及FW-130作为亲本,采用基因组改组技术,经过三轮递推式融合后筛选得到一株能够稳定遗传的改组菌株F3-542,其酶活较原始菌株提高了61.5%,发酵周期也相对缩短了24h,达到了选育高产菌株的目的。对改组菌株F3-542的发酵条件进行优化,首先通过单因素实验可知最佳碳源为玉米粉,最佳有机氮源为牛肉膏,最佳无机氮源为硝酸钠。最适培养条件为：初始pH值为6；接种量为10%；装液量为50mL/250mL三角瓶。通过均匀设计法对培养基配方进行进一步优化,获得它们的最佳组合(g/L)：玉米粉56,牛肉膏26,NaNO34.5,K2HP041.4,MgS041.5,FeS040.005。整体优化后,改组菌F3-542从最初酶活力为3920U/mL提高至5147.5U/mL,比最初酶活力提高了31.3%。

全文目录


摘要  2-3Abstract  3-5中文文摘  5-7目录  7-12绪论  12-28  1 α-淀粉酶的概述  12-18    1.1 淀粉及淀粉酶  12-13      1.1.1 淀粉  12      1.1.2 淀粉酶  12-13    1.2 α-淀粉酶  13-18      1.2.1 α-淀粉酶的应用  14-15      1.2.2 α-淀粉酶的活性测定方法  15      1.2.3 α-淀粉酶的来源与生产  15-16      1.2.4 α-淀粉酶菌种的选育进展  16-18  2 基因组改组育种技术  18-24    2.1 基因组改组技术的原理  18-19    2.2 基因组改组技术的优点  19-20    2.3 基因组改组技术的应用实例  20-21    2.4 基因组改组技术的方法  21-24      2.4.1 原生质体制备和再生  21-22      2.4.2 原生质体融合  22-23      2.4.3 融合子的检出  23-24  3 发酵条件的优化研究  24-26    3.1 发酵培养基的研究  24    3.2 发酵培养条件的研究  24-25    3.3 试验设计与优化  25-26  4 本论文的目的意义及研究内容  26-28第一章 米曲霉传统诱变的研究  28-40  1 材料与方法  28-31    1.1 实验材料  28-30      1.1.1 菌种  28      1.1.2 主要药品与试剂  28-29      1.1.3 主要仪器  29      1.1.4 培养基  29-30    1.2 实验方法  30-31      1.2.1 α-淀粉酶活力的测定  30      1.2.2 葡萄糖对米曲霉α-淀粉酶合成的影响  30      1.2.3 诱变处理过程  30-31        1.2.3.1 单孢子悬液的制备  30-31        1.2.3.2 紫外线处理  31        1.2.3.3 微波处理  31      1.2.4 突变株筛选  31        1.2.4.1 突变株初筛  31        1.2.4.2 突变株复筛  31  2 结果与分析  31-37    2.1 葡萄糖对米曲霉α-淀粉酶合成的影响  31-33      2.1.1 摇瓶培养中葡萄糖对米曲霉α-淀粉酶合成的影响  32-33      2.1.2 平板培养中葡萄糖对米曲霉α-淀粉酶合成的影响  33    2.2 紫外诱变构建正突变库  33-35      2.2.1 紫外诱变剂量的选择  33-34      2.2.2 紫外诱变菌株的筛选结果  34-35    2.3 微波诱变构建正突变库  35-37      2.3.1 微波诱变剂的选择  35      2.3.2 微波诱变菌株的筛选结果  35-37  3 讨论与小结  37-40    3.1 不同诱变方法对构建正突变库的影响  37    3.2 不同初筛方案对筛选正突变株的影响  37-38    3.3 小结  38-40第二章 米曲霉原生质体制备与再生条件研究  40-52  1 材料与方法  40-41    1.1 实验材料  40-41      1.1.1 菌种  40      1.1.2 主要药品与试剂  40      1.1.3 主要仪器  40      1.1.4 培养基  40-41    1.2 实验方法  41      1.2.1 菌丝体培养  41      1.2.2 酶液的配制  41      1.2.3 原生质体的制备与再生  41  2. 结果和分析  41-50    2.1 菌龄的选择  41-42    2.2 酶液组成的选择  42-46      2.2.1 单一酶液对原生质体形成量的影响  42-43      2.2.2 响应面分析实验  43-46    2.3 酶解时间的选择  46    2.4 酶解温度的选择  46-47    2.5 渗透压稳定剂的选择  47-48    2.6 再生培养基的选择  48-49    2.7 米曲霉原生质体形态观察  49-50  3 讨论与小结  50-52第三章 基因组改组选育α-淀粉酶高产菌株  52-66  1 材料与方法  52-55    1.1 实验材料  52-53      1.1.1 菌种  52      1.1.2 主要药品与试剂  52-53      1.1.3 主要仪器  53      1.1.4 培养基  53    1.2 实验方法  53-55      1.2.1 米曲霉原生质体灭活标记  53-54      1.2.2 米曲霉原生质体融合  54      1.2.3 米曲霉基因组改组  54-55  2 结果与分析  55-63    2.1 米曲霉原生质体灭活实验  55-56      2.1.1 紫外灭活  55      2.1.2 热灭活  55-56    2.2 米曲霉原生质体融合条件的选择  56-59      2.2.1 PEG浓度的选择  56-57      2.2.2 融合时间的选择  57      2.2.3 融合温度的选择  57-58      2.2.4 Ca~(2+)浓度的选择  58-59    2.3 米曲霉基因组改组  59-63      2.3.1 出发菌株的确定  59      2.3.2 第一轮基因组改组  59-60      2.3.3 第二轮基因组改组  60      2.3.4 第三轮基因组改组  60-61      2.3.5 改组菌F3-542与原始菌株FS-16的性状比较  61-63      2.3.6 改组菌F3-542的稳定性实验  63  3 讨论与小结  63-66第四章 米曲霉F3-542产α-淀粉酶发酵优化  66-76  1 材料与方法  66-68    1.1 实验材料  66      1.1.1 菌种  66      1.1.2 主要药品与仪器  66      1.1.3 培养基  66    1.2 实验方法  66-68      1.2.1 培养方法  66-67      1.2.2 α-淀粉酶活力的测定  67      1.2.3 单因素实验  67      1.2.4 均匀设计法优化培养基配方试验  67-68  2 结果与分析  68-74    2.1 单因素实验  68-71      2.1.1 碳源对产酶的影响  68      2.1.2 氮源对产酶的影响  68-69      2.1.3 培养基初始pH值对产酶的影响  69-70      2.1.4 装液量对产酶的影响  70-71      2.1.5 接种量对产酶的影响  71    2.2 均匀设计法优化培养基配方试验  71-74  3 小结  74-76第五章 结论与展望  76-78  1 研究结论  76-77    1.1 米曲霉传统诱变育种构建正突变库  76    1.2 米曲霉原生质体制备和再生的研究  76    1.3 米曲霉基因组改组育种  76    1.4 突变株F3-542发酵优化  76-77    1.5 米曲霉α-淀粉酶高产菌株总结图  77  2 展望  77-78参考文献  78-84攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  84-86致谢  86-88个人简历  88-90

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
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