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葡萄糖转化异丁醇代谢途径的设计与表达

作　者: 谢厦
导　师: 闻建平
学　校: 天津大学
专　业: 生物化工
关键词: 异丁醇枯草芽孢杆菌表达载体异源表达
分类号: TQ923
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

能源问题和环境问题日益严峻,使得人们越来越关注生物质能源的研究。与传统生物质能源——乙醇相比,高碳醇,特别是支链高碳醇,具有较小的挥发性和腐蚀性,较高的辛烷值和能量密度。2008年,James C Liao课题组在大肠杆菌中利用非发酵途径方法合成了异丁醇,经对异丁醇代谢途径及发酵工艺不断优化后,得率达到了理论值的86%。然而,发酵结束后仍有一部分的葡萄糖没有被利用,表明高浓度的异丁醇产物抑制了大肠杆菌的代谢。研究表明,枯草芽孢杆菌对异丁醇的耐受性高于大肠杆菌,并且自身具有异丁醇合成途径的优势基因,因此,本研究选择在枯草芽孢杆菌中利用合成生物学的思想构建异丁醇的代谢通路,以缬氨酸生物合成途径中的α-酮异戊酸盐为前体物,展开合成异丁醇的相关研究。本实验以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌的穿梭质粒pHP13为基础,连接了枯草芽孢杆菌中的强启动子p43,构建了表达载体pP。从乳酸乳球菌基因组DNA上克隆下脱羧酶编码基因kivd,从酿酒酵母基因组DNA上克隆下脱氢酶基因ADH2,依次连接在表达载体pP上,由p43启动子启动两个基因的表达,构建了重组载体pPKA。采用Spizizen转化法将重组载体pPKA转入B. subtilis 168中,获得了重组菌B. subtilis 168/pPKA。经气质联用鉴定,重组菌的发酵液中有异丁醇存在,说明两个外源基因在重组菌中成功表达,催化α-酮异戊酸盐生成了异丁醇。在成功获得异丁醇生产菌株B. subtilis 168/pPKA后,对其培养条件进行了优化,优化内容包括培养基中葡萄糖的加入量和缬氨酸的加入量,发酵时间,接种量,装液量,初始pH等。优化结果为发酵培养基中葡萄糖的加入量为3%,缬氨酸的加入量为2%,接种量为1%,装液量为50ml/250ml,初始pH为7,发酵时间为35h。最终异丁醇的产量为0.607g/l。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-7
第一章文献综述  7-29
  1.1 前言  7-8
  1.2 合成生物学  8-10
    1.2.1 合成生物学的定义  8-9
    1.2.2 合成生物学与基因工程的异同点  9
    1.2.3 合成生物学在生物燃料方面的应用  9-10
    1.2.4 合成生物学的伦理道德和生物安全  10
  1.3 燃料醇类的代谢途径分析  10-20
    1.3.1 酿酒酵母中燃料醇类的代谢途径分析  11-13
    1.3.2 细长聚球藻中燃料醇类的代谢途径分析  13-15
    1.3.3 大肠杆菌中燃料醇类的代谢途径分析  15-20
  1.4 脱羧酶和脱氢酶  20-22
  1.5 枯草芽孢杆菌表达系统  22-26
    1.5.1 RNA聚合酶  22-23
    1.5.2 启动子  23-24
    1.5.3 核糖体结合位点  24
    1.5.4 载体  24-25
    1.5.5 外源蛋白的胞内表达  25-26
  1.6 选题背景及研究思路  26-29
    1.6.1 选题背景  26-27
    1.6.2 研究内容及思路  27-29
第二章 B.Subtilis 168 中构建异丁醇合成代谢通路  29-60
  2.1 实验材料  29-33
    2.1.1 菌种与质粒  29-30
    2.1.2 实验仪器  30-31
    2.1.3 实验试剂  31-32
    2.1.4 培养基  32
    2.1.5 主要试剂  32-33
  2.2 实验方法  33-40
    2.2.1 细菌染色体DNA提取  33-34
    2.2.2 酵母DNA的快速分离  34
    2.2.3 琼脂糖凝胶电泳  34
    2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备  34-35
    2.2.5 大肠杆菌的转化  35
    2.2.6 利用α互补筛选目的转化子  35
    2.2.7 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的质粒提取  35-36
    2.2.8 琼脂糖凝胶DNA回收  36-37
    2.2.9 引物设计及PCR反应  37
    2.2.10 PCR产物纯化  37-39
    2.2.11 酶切体系  39
    2.2.12 加A体系  39-40
    2.2.13 连接体系  40
    2.2.14 枯草芽孢杆菌Spizizen转化  40
  2.3 结果与讨论  40-59
    2.3.1 表达载体pP的构建  41-46
    2.3.2 重组载体pPK的构建  46-52
    2.3.3 重组载体pPKA的构建  52-55
    2.3.4 重组质粒pPKA转化B. subtilis 168  55-56
    2.3.5 重组菌代谢异丁醇的定性实验  56-59
  2.4 小结  59-60
第三章 B. Subtilis 168/pPKA发酵异丁醇条件优化  60-67
  3.1 材料与方法  60-62
    3.1.1 实验试剂  60-61
    3.1.2 实验仪器  61
    3.1.3 培养基  61
    3.1.4 异丁醇浓度测定  61-62
  3.2 结果与讨论  62-66
    3.2.1 菌体生长曲线的测定  62
    3.2.2 最佳发酵时间的测定  62-63
    3.2.3 碳源（葡萄糖）最佳加入量的测定  63
    3.2.4 缬氨酸最佳加入量测定  63-64
    3.2.5 最佳接种量的测定  64
    3.2.6 最佳装液量的测定  64-66
    3.2.7 最佳初始pH的测定  66
  3.3 小结  66-67
第四章结论与展望  67-69
  4.1 结论  67
  4.2 创新点  67
  4.3 展望  67-69
参考文献  69-73
致谢  73

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