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苹果砧木遗传转化体系优化与rolB基因遗传转化研究

作　者: 李海云
导　师: 王铭
学　校: 吉林农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果砧木 腋芽增殖 叶片再生 遗传转化 生根
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 213次
引　用: 1次
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内容摘要


由于矮化密植具有早果、丰产等优点,已成为国内外果树,特别是苹果生产的发展趋势。目前,在苹果生产中,树体矮化主要是通过选育矮密品种和采用矮化砧木来达到致矮目的,其中矮化砧是最理想的办法。苹果半矮化中间砧GM256具有矮化、抗寒、抗旱、抗盐碱等优良特征,由于生根困难,只能用于做矮化中间砧,丢掉了抗旱、抗盐碱等优良性状。转基因技术为苹果矮化砧的遗传改良开辟了一条新途径。利用转基因技术将rolB基因导入苹果矮化砧GM256中,极有希望获得矮化、抗寒、抗旱、抗盐碱、扦插易生根,适于矮化密植的砧木新品种。 由于苹果离体再生困难,极大限制了苹果的转基因改良。本试验从苹果矮化砧木品种M9和GM256组织培养体系的研究着手,优化苹果矮化砧的遗传转化体系,力争建立GM256和M9的遗传转化体系。主要取得以下研究结果: 1.稳定、高效的腋芽增殖体系研究 由建立无菌体系开始,对影响初代培养的因素进行了优化。结果表明,在新梢还未抽生前,最佳的接芽状态是待侧芽已露出4～5片小叶时接种;新梢快速生长期(4-5月)是最佳的取材时期;采用综合防治的方法即在初代培养基中附加0.1%的活性炭,同时结合连续转移外植体,黑暗培养,有效防止了木本植物组织培养当中普遍存在的褐化现象。 同时发现,GM256生长点伸长生长困难,而M9在BN2(MS+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L)培养基中可形成带有明显茎节的植株。以M9带单芽或双芽的茎段为外植体,通过正交试验筛选出适宜的腋芽分化培养基FH8(MS+BA5.0mg/L+NAA0.02mg/L)。将带腋芽茎段先在分化培养基中培养7天,然后将其转入无激素培养基中促进芽的生长,腋芽分化率可达到98%,增殖倍数为5.1。较大的芽被切离母体单独培养,将茎段剩余部分作继代培养,继代3次后仍有芽不断分化,增殖倍数又可提高,是一种较优的增殖途径。 2.不同因素对苹果离体叶片再生的影响 (1) 激素对再生的影响:细胞分裂素是影响叶片再生频率的重要因子。通过设计细胞分裂素和生长素组成不同的激素组合,研究了激素对叶片组织再生的影响。使用细胞分裂素BA与生长素NAA组合时,叶片可膨大,随BA浓度提高,叶片产生愈伤组织的量增加;使用KT与NAA组合时,叶片只是膨大,变脆,无愈伤组织的生成。而将M9叶片培养在BK3(MS+BA1.0mg/L+KT1.5mg/L+NAA0.8mg/L+IBA0.5mg/L)分化培养基中,获得16.7%的再生频率。细胞分裂素TDZ对诱导苹果离体叶片再生最有效。M9叶片在适宜的分化培养基MT3(MS+TDZ3.0mg/L+NAA0.5mg/L)中获得37.6%的再生频率,而GM256叶片未再生,这也许与它的基因型有关。在此培养基中再生出的不定芽不易伸长生长,且

全文目录


中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
缩略词  13-14
前言  14-23
1 材料与方法  23-30
  1．1 材料  23-24
  1．2 试验设计与方法  24-30
    1．2．1 影响初代培养效果的因素  24-25
      1．2．1．1 外植体的表面消毒方法  24
      1．2．1．2 接种生理状态对污染率的影响  24
      1．2．1．3 HgCl_2处理时间对外植体的影响  24
      1．2．1．4 不同采集时间对外植体的影响  24
      1．2．1．5 活性炭的防褐效应  24
      1．2．1．6 不同激素组合对芽伸长生长的影响  24-25
    1．2．2 腋芽增殖体系建立  25
    1．2．3 叶片再生体系建立  25-26
      1．2．3．1 激素对叶片再生不定芽的影响  25
      1．2．3．2 叶片切割方式与叶片不同部位对再生频率的影响  25
      1．2．3．3 叶片放置方向对叶片再生的影响  25-26
      1．2．3．4 培养基中糖对叶片再生的影响  26
      1．2．3．5 叶片来源对再生的影响  26
    1．2．4 生根试验设计  26
    1．2．5 卡那霉素敏感性测定  26
    1．2．6 农杆菌转化的试验设计与方法  26-30
  1．3 评价指标和计算公式  30
  1．4 培养条件  30
  1．5 主要仪器设备  30
2 结果与分析  30-45
  2．1 影响初始培养因素分析  30-33
    2．1．1 不同接芽状态对污染率的影响  30-31
    2．1．2 HgCl_2处理时间对外植体的影响  31
    2．1．3 不同采集时间对外植体的影响  31-32
    2．1．4 活性炭防治褐化的效应  32
    2．1．5 不同激素组合对芽伸长生长的影响  32-33
  2．2 腋芽增殖体系建立  33-35
    2．2．1 茎段摆放方式对萌芽率的影响  34-35
  2．3 叶片再生体系的建立  35-41
    2．3．1 叶片不定芽再生的动态过程  35-36
    2．3．2 激素对叶片再生不定芽的影响  36-39
      2．3．2．1 细胞分裂素BA与KT对叶片再生不定芽的影响  36
      2．3．2．2 新型细胞分裂素TDZ对叶片再生的影响  36-38
      2．3．2．3 TDZ对诱导形成的不定芽形态的影响  38-39
    2．3．3 培养基中糖对叶片再生的影响  39
    2．3．4 其他影响叶片再生的因素分析  39-41
      2．3．4．1 叶片放置方向对苹果叶片再生的影响  39-40
      2．3．4．2 叶片切割方式与不同部位叶片再生频率的比较  40-41
      2．3．4．3 叶片来源对再生的影响  41
      2．3．4．4 基因型对叶片再生的影响  41
  2．4 卡那霉素敏感性测定结果  41-43
  2．5 转化roIB基因的研究  43-45
    2．5．1 农杆菌生长曲线的分析  43
    2．5．2 农杆菌介导转化的结果  43-44
    2．5．3 PCR检测  44-45
  2．6 生根植株的驯化和移栽  45
3 讨论  45-52
  3．1 植物基因转移对受体系统的要求  45-46
  3．2 关于试管苗玻璃化现象  46
  3．3 影响叶片不定芽再生的因素  46-50
    3．3．1 影响苹果叶片再生的内在因素  46-47
    3．3．2 影响苹果叶片再生的外在因素  47-50
  3．4 关于苹果砧木生根  50-52
4 结论  52-53
参考文献  53-62
图版  62-63
致谢  63-64

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 仁果类 > 苹果
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