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新疆紫草细胞的稀土生物学效应及遗传转化

作　者: 黄文虎
导　师: 葛锋
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 新疆紫草稀土元素遗传转化实时荧光定量PCR
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

紫草素及其衍生物具有多种生物学活性,在医药、食品、化妆品、印染等领域有着巨大的市场潜力。2010年版《中国药典》中收录的新疆紫草是主要的生药材。由于新疆紫草的生境受到破坏,而市场的需求不断增加,使其供求矛盾日益突出,迫切需要应用现代生物技术手段解决生药材短缺问题。本研究以新疆紫草细胞为实验材料,基于植物细胞工程研究方法,着重探讨了稀土元素对新疆紫草细胞生长和紫草素合成的影响。新疆紫草细胞生长和合成紫草素是非耦联的,因此第一步研究稀土元素在固体生长培养基上对新疆紫草细胞生长的影响；第二步研究了稀土元素在固液合成培养基上对新疆紫草细胞合成紫草素的影响；并从基因调控的角度初步探讨了稀土元素铈调控紫草素生物合成的分子机制,为利用代谢工程技术提高目标产物的合成做了一些基础研究。另外,在固体培养基中研究了稀土元素对激动素的替代作用,探讨了稀土元素的类激素效应。最后,在新疆紫草素细胞的遗传转化方面做了一些工作,初步建立了农杆菌侵染新疆紫草细胞的优化体系。本研究获得的主要研究结果如下：1.研究了稀土元素取代激动素的类激素效应。稀土元素镧(La)、钕(Nd)、钆(Gd)、钐(Sm)、铈(Ce)、镨(Pr)的效果虽然都比不上KT对紫草细胞生长和紫草素合成的影响,但与不加激动素的培养过程相比,低浓度稀土元素处理时表现出促进作用,而在相对高浓度稀土处理以后,表现出一定的抑制作用,呈现出Hormesis效应。2.实验所用六种稀土元素在整个实验浓度范围内对细胞的生长和紫草素合成表现出Hormesis效应。同时固体培养基中的紫草素含量都比液体培养基中的高。3.利用实时荧光定量PCR定性研究了稀土元素铈对新疆紫草细胞生物合成调控的分子机制。DPI、4CL、HMGS、C4H是紫草素生物合成中的相关酶基因。实验结果表明,适当浓度的Ce可以提高DPI表达水平,基本维持HMGS和C4H表达水平,降低4CL表达水平,最终表现出紫草素合成量的增加。4.优化了新疆紫草细胞农杆菌介导的遗传转化参数,最终确定新疆紫草细胞侵染的最适菌株为农杆菌EHA105,侵染浓度为OD6000.7,侵染时间为10 min,共培养时间为48 h,共培养温度为时间25℃,并在农杆菌活化培养基中加入50mg/L的乙酰丁香酮。

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摘要 4-5ABSTRACT 5-7目录 7-11插图和附表清单 11-14第一章文献综述 14-25 1.1 植物细胞工程 14-18 1.1.1 植物细胞工程的起始阶段 14 1.1.2 植物细胞工程的发展阶段 14-17 1.1.3 植物细胞工程的未来发展趋势 17-18 1.2 紫草素及其衍生物的研究概况 18-23 1.2.1 紫草素衍生物的概述 18-19 1.2.1.1 紫草素及其衍生物的药理作用 18-19 1.2.1.2 紫草素及其衍生物的生物合成途径 19 1.2.2 紫草素及其衍生物的调控策略 19-23 1.2.2.1 紫草素及其衍生物高产细胞系的筛选 19-20 1.2.2.2 通过改良培养基促进紫草素及其衍生物的合成 20-22 1.2.2.3 外加物和外加条件对紫草素及其衍生物合成的影响 22 1.2.2.4 通过基因工程调控紫草素及其衍生物的合成 22-23 1.2.3 展望 23 1.3 研究的目的和意义 23-25第二章六种稀土元素对新疆紫草细胞生长代谢的影响 25-50 2.1 前言 25-27 2.1.1 稀土元素在植物学方面的研究简介 25-26 2.1.2 实时荧光定量PCR简介 26-27 2.2 材料和试剂 27-28 2.2.1 植物材料 27 2.2.2 主要试剂和培养基 27 2.2.3 主要缓冲液 27-28 2.3 实验方法 28-29 2.3.1 新疆紫草细胞培养方法 28 2.3.2 新疆紫草细胞干、湿重测定方法 28 2.3.3 新疆紫草细胞的生长曲线 28-29 2.3.4 紫草素含量测定方法 29 2.4 六种稀土元素对新疆紫草细胞生长的影响 29-30 2.5 六种稀土元素对新疆紫草细胞生物合成紫草素的影响 30-38 2.5.1 六种稀土元素对生长在M10+KT固体培养基中新疆紫草细胞生物合成的影响 30-34 2.5.2 六种稀土元素对生长在M10+KT液体培养基中新疆紫草细胞生物合成的影响 34-38 2.6 稀土元素Ce调控机制的Real Time-PCR检测定性分析 38-43 2.6.1 实验方法 38-42 2.6.1.1 RNA的提取与初步纯化 38-39 2.6.1.2 RNA纯化 39-40 2.6.1.3 RNA定量 40 2.6.1.4 合成cDNA 40 2.6.1.5 PCR反应 40-41 2.6.1.6 实时荧光PCR定性检测 41-42 2.6.2 结果和讨论 42-43 2.6.2.1 样品RNA的提取纯化、逆转录和PCR结果 42-43 2.6.2.2 稀土元素Ce调控机制的定性检测 43 2.7 稀土元素对新疆紫草细胞生长代谢的类激素作用 43-48 2.7.1 六种稀土元素对生长在N6培养基中新疆紫草细胞生长的影响 43-44 2.7.2 六种稀土元素对生长在M10培养基中新疆紫草细胞生物合成的影响 44-48 2.8 本章小结与讨论 48-50 2.8.1 稀土元素对细胞生长和次级代谢影响的讨论 48-49 2.8.2 稀土元素Ce调控紫草素合成的分子机制的讨论 49-50第三章农杆菌介导新疆紫草细胞遗传转化体系的优化 50-69 3.1 前言 50-52 3.1.1 农杆菌介导法简介 50-51 3.1.2 Gus基因概述 51-52 3.2 材料 52-53 3.2.1 受体植物材料 52 3.2.2 菌株和载体 52 3.2.3 缓冲液和培养基配方 52-53 3.3 实验步骤和方法 53-54 3.3.1 Gus基因瞬时表达的实验步骤和方法 53-54 3.3.2 转化后连续培养的筛选 54 3.4 农杆菌LBA4404侵染参数的优化 54-60 3.4.1 农杆菌侵染参数的优化设计 54-55 3.4.1.1 乙酰丁香酮(AS) 54 3.4.1.2 共培养时间 54 3.4.1.3 农杆菌菌液浓度 54-55 3.4.1.4 侵染时间 55 3.4.1.5 共培养温度 55 3.4.2 农杆菌侵染参数的优化结果 55-59 3.4.2.1 乙酰丁香酮(AS) 55-56 3.4.2.2 共培养时间 56-57 3.4.2.3 农杆菌菌液浓度 57-58 3.4.2.4 侵染时间 58-59 3.4.2.5 共培养温度 59 3.5.2 小结 59-60 3.5 农杆菌EHA105侵染参数的优化 60-66 3.5.1 农杆菌侵染参数的优化设计 60-61 3.5.1.1 乙酰丁香酮(AS) 60 3.5.1.2 侵染时间 60 3.5.1.3 共培养时间 60 3.5.1.4 共培养温度 60 3.5.1.5 农杆菌菌液浓度 60-61 3.5.2 农杆菌侵染参数的优化结果 61-65 3.5.2.1 乙酰丁香酮(AS) 61 3.5.2.2 侵染时间 61-62 3.5.2.3 共培养时间 62-63 3.5.2.4 共培养温度 63-64 3.5.2.5 农杆菌菌液浓度 64-65 3.5.3 小结 65-66 3.6 新疆紫草细胞转化体瞬时表达效果的筛选 66 3.7 新疆紫草细胞转化体筛选压的确定 66 3.8 本章小结与讨论 66-69 3.8.1 侵染条件优化的结论与讨论 66-68 3.8.2 筛选培养基的结论与讨论 68-69第四章结论与展望 69-72 4.1 结论 69-70 4.2 展望 70-72致谢 72-73参考文献 73-78附录数据表 78-87附录攻读硕士期间发表论文目录 87

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