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枣叶片再生途径的组织学研究及影响遗传转化因素的分析

作　者: 马春华
导　师: 冯建灿
学　校: 河南农业大学
专　业: 森林培育
关键词: 灰枣植株再生不定芽组织学遗传转化
分类号: S665.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

枣(Zizyphus jujuba Mill.)是我国第一大干果树种。枣花蕾小、自然坐果率低、胚败育率高等因素,传统杂交育种方法存在周期长、效率低等问题,获得优质多抗的枣新品种困难重重。本试验以灰枣叶片为试材,对外植体、培养基、生长激素浓度组合、外植体放置方式、蔗糖浓度等影响叶片再生的因素进行了研究,并对灰枣离体再生不定芽途径进行组织学观察;在所建立的再生体系基础上,对灰枣叶片的遗传转化进行了初步研究。主要试验结果如下:1.灰枣叶片再生体系建立试验结果表明,灰枣叶片离体再生不定芽的适宜培养基为WPM﹢TDZ 0.5mg/L﹢NAA 0.2mg/L;最佳叶片来源为灰枣组培苗中部平展,大而厚叶片;近叶柄处再生率比近叶尖处高;以远轴面接触培养基叶片再生率较高为69.61%;蔗糖浓度为40g/L可降低再生芽的玻璃化程度;叶片暗培养时间以10d叶片再生率较高为81.6%;0.5mg/L AgNO3和0.1 mg/L的STS均提高了灰枣叶片再生率,再生率分别为82.25%,91.26%。2.灰枣叶片离体再生途径的组织学研究以灰枣叶片为外植体,对叶片离体培养再生不定芽过程进行了解剖学观察。将叶片接种于附加0.5mg/L TDZ,0.2mg/LNAA和0.5mg/LAgNO 3的WPM分化培养基上,经过10d的暗培养,随后转至14h/10h光照培养条件下继续进行不定芽诱导培养。组织学研究结果表明,灰枣叶片不定芽主要起源于维管束周围的薄壁细胞,发生过程不经历愈伤组织阶段。最初是维管束周围的薄壁细胞启动分裂,之后加速分裂形成分生组织细胞团,进而分裂形成不定芽点。3.灰枣遗传转化研究试验研究了卡那霉素对叶片再生和不同共培养时间对转化率的影响。试验结果表明,当灰枣叶片再生培养基中添加40mg/L卡那霉素能抑制不定芽的分化,因此在后续筛选培养中使用卡那霉素浓度为40mg/L;灰枣遗传转化中,共培养2d转化率最高,为21.1%;对获得的灰枣转化植株叶片进行组织化学染色分析,初步确定外源基因已转入灰枣基因组中。

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致谢 4-9缩略词表 Abbreviation 9-10摘要 10-11文献综述 11-25 1 枣组织培养研究进展 11-16 1.1 植物组织培养相关概念 11 1.2 枣组织培养研究进展 11-16 1.2.1 营养器官培养 11-12 1.2.2 愈伤组织培养 12-14 1.2.3 胚培养 14 1.2.4 花药培养 14-15 1.2.5 原生质体培养 15 1.2.6 多倍体培养 15-16 2 枣离体叶片再生不定芽研究进展 16-19 2.1 外植体 17 2.1.1 叶片来源 17 2.1.2 叶片质量 17 2.2 基本培养基的选择 17-18 2.3 生长调节物质的影响 18 2.4 褐化的防止 18-19 2.5 培养条件 19 3 植物叶片再生形态发生的研究进展 19-23 3.1 植物叶片离体再生形态发生过程研究概况 19-20 3.2 影响植物叶片离体形态发生的因素 20-22 3.2.1 外植体 20-21 3.2.2 培养基 21-22 3.2.3 培养条件 22 3.3 枣叶片离体再生形态发生过程研究概况 22-23 3.4 研究枣叶片离体再生途径的意义 23 4. 植物的遗传转化 23-25 4.1 农杆菌介导的遗传转化 23-24 4.2 枣遗传转化研究进展 24-25第一章灰枣叶片培养及不定芽再生途径的细胞学观察 25-43 第一节灰枣叶片再生不定芽研究 25-36 1 材料与方法 25-27 1.1 试验材料 25 1.1.1 植物材料 25 1.1.2 药品试剂 25 1.1.3 仪器设备 25 1.2 试验方法 25-27 1.2.1 叶片再生培养基的筛选 25-26 1.2.2 影响叶片再生的因素 26 1.2.3 数据统计与分析 26-27 2 结果与分析 27-32 2.1 不同培养基及生长调节剂组合对灰枣叶片再生不定芽的影响 27-28 2.2 不同部位的叶片对灰枣叶片再生不定芽的影响 28 2.3 同一叶片不同部位对灰枣叶片再生不定芽的影响 28-29 2.4 接种方向对灰枣叶片再生不定芽的影响 29 2.5 蔗糖浓度对灰枣叶片再生不定芽的影响 29-30 2.6 暗培养时间对灰枣叶片再生不定芽的影响 30 2.7 乙烯抑制剂灰枣叶片再生的影响 30-32 2.7.1 AgN03 浓度对灰枣叶片再生的影响 30-31 2.7.2 硫代硫酸银对灰枣叶片再生的影响 31-32 3 小结 32-35 3.1 基本培养基和生长调节剂对灰枣叶片再生不定芽的影响 32 3.2 外植体质量对灰枣叶片再生不定芽的影响 32-33 3.2.1 不同部位叶片对灰枣叶片再生的影响 33 3.2.2 同一叶片不同部位对灰枣叶片再生的影响 33 3.3 叶片的放置方式对灰枣叶片再生不定芽的影响 33 3.4 光照条件对灰枣叶片再生的影响 33-34 3.5 蔗糖对灰枣叶片再生的影响 34 3.6 乙烯抑制剂对灰枣叶片不定芽再生的影响 34-35 图版 35-36 第二节灰枣叶片诱导分化不定芽的组织学研究 36-43 1 材料与方法 36-37 1.1 试验材料 36 1.2 试验方法 36-37 1.2.1 材料培养 36 1.2.2 形态学观察 36 1.2.3 组织学观察 36-37 2 结果与分析 37-38 2.1 枣叶片离体再生不定芽的形态学观察 37 2.2 枣叶片离体再生不定芽的解剖学观察 37-38 3. 小结 38-39 图版 39-43第二章灰枣叶片遗传转化影响因素的初步研究 43-51 1 材料与方法 43-46 1.1 材料 43-44 1.1.1 植物材料 43 1.1.2 菌株 43 1.1.3 生化试剂 43 1.1.4 主要试剂配制 43-44 1.1.5 仪器设备 44 1.1.6 培养基 44 1.2 试验方法 44-46 1.2.1 抗生素Kan 对灰枣叶片离体再生的影响 44-45 1.2.2 农杆菌的活化与培养 45 1.2.3 转化 45 1.2.4 转化植株的获得与检测 45 1.2.5 GUS 组织化学检测 45-46 2 结果与分析 46-47 2.1 灰枣对卡那霉素的敏感性试验分析 46 2.2 共培养时间对抗性芽再生的影响 46-47 2.3 转基因植株的检测 47 3 小结 47-49 3.1 卡那霉素对灰枣叶片再生的影响 47 3.2 灰枣遗传转化中共培养时间的筛选 47-48 3.3 转化植株的获得与检测 48-49 图版 49-51第三章问题与讨论 51-53 3.1 叶片直接再生不定芽 51 3.2 灰枣叶片不定芽发生途径分析 51 3.3 影响灰枣叶片遗传转化效率的因素 51-52 3.4 本研究的下一步工作 52-53参考文献 53-60Abstract 60-62摘要 62

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