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大豆GmFtsH基因的遗传转化及功能分析

作 者: 齐玉军
导 师: 杨守萍
学 校: 南京农业大学
专 业: 遗传学
关键词: 大豆 GmFtsH 遗传转化 功能分析
分类号: S565.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


FtsH是由ftsH基因编码的一种ATP和Zn2+依赖的兼职蛋白,兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和类分子伴侣活性,参与生物体内许多生理代谢的调节,在植物中与多种逆境胁迫密切相关。目前研究认为FtsH蛋白参与PSⅡ核心蛋白D1蛋白光氧化损伤的降解,是植物抵抗光抑制,修复PSⅡ正常功能的关键成分之一。大豆中还没有该基因的相关研究报道。因此,本研究拟在大豆中克隆ftsH基因,分析其生物信息学特征,转化烟草并初步鉴定其功能,获得主要结果如下:1.从大豆科丰一号中克隆了GmFtsH基因的cDNA全长,多重序列比较分析表明GmFtsH与其它植物物种FtsH具有很高的同源性,有共同的保守结构域,属于AAA蛋白酶家族成员;以克隆的GmFtsH为查询序列,搜索大豆基因组数据库,发现GmFtsH基因定位于15号染色体,编码区包括4个外显子和3个内含子;系统发育分析表明GmFtsH与AtFtsH2、AtFtsH8、Nt1亲缘关系较近。2.对大豆科丰一号幼苗进行光氧化和干旱胁迫下GmFtsH在不同组织中的荧光定量表达分析,结果表明GmFtsH在光氧化剂MV作用下,在根和叶中的表达量随时间变化呈上升趋势,在茎中先出现抑制表达,4小时后表达量上升,至12小时达到原初表达量的8倍,说明GmFtsH是受MV诱导表达的,与光氧化胁迫密切相关;在干旱胁迫下,根和茎中的表达量随时间变化不明显,在叶中表达量随时间变化呈上升趋势,说明GmFtsH在叶中受PEG6000诱导表达,与干旱胁迫有关,且调节的部位可能在叶中。3.构建植物过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法进行GmFtsH基因的烟草遗传转化,对鉴定为阳性的转基因烟草植株进行抗干旱和抗氧化能力验证,结果显示转基因烟草提高了抗光氧化和抗干旱胁迫能力。

全文目录


摘要  7-8ABSTRACT  8-10第一部分 文献综述  10-30  第一章 植物光胁迫及FtsH的分析研究  11-29    1 植物光胁迫研究进展  11-24      1.1 植物光抑制的形成  11-17        1.1.1 PSⅡ的光抑制及其机理  12-14        1.1.2 PSⅠ的光抑制及其机理  14-16        1.1.3 光抑制过程中PSⅡ和PSⅠ的关系  16-17      1.2 植物的光破坏  17-19      1.3 植物光胁迫下的防御机制  19-24        1.3.1 叶黄素循环的光保护机制  20-22        1.3.2 电子传递  22-23        1.3.3 活性氧清除机制  23-24    2 金属蛋白酶FtsH的研究进展  24-29      2.1 FtsH的发现和同系物的多样性  24      2.2 FtsH结构  24-26        2.2.1 N端跨膜域  25        2.2.2 AAA结构域(AAA domain)  25-26        2.2.3 Zn~(2+)结合结构域(Zinc-binding domain)  26      2.3 FtsH功能和作用机制  26-29        2.3.1 原核生物中FtsH的功能和作用机制  27-28        2.3.2 真核生物中FtsH的功能和作用机制  28-29  本研究的目的和意义  29-30第二部分 实验论文  30-57  第二章 GmFtsH的克隆、过表达载体构建及表达分析  31-45    1 材料与方法  31-36      1.1 植物材料  31      1.2 材料处理  31      1.3 主要仪器及试剂  31      1.4 菌株和载体  31-32      1.5 方法与步骤  32-36        1.5.1 大豆总RNA的提取  32        1.5.2 cDNA第一链的合成  32-33        1.5.3 GmFtsH基因cDNA克隆  33-34        1.5.4 GmFtsH基因序列分析  34        1.5.5 GmFtsH基因多重序列比对与系统进化分析  34        1.5.6 荧光定量QRT-PCR胁迫分析  34-35        1.5.7 Gate Way技术体系构建植物过表达载体  35-36    2 结果与分析  36-44      2.1 RNA提取和cDNA合成  36-37      2.2 GmFtsH全长cDNA的克隆  37-39      2.3 GmFtsH基因序列生物信息学分析  39-41      2.4 GmFtsH在不同逆境胁迫下的诱导表达分析  41      2.5 Gateway体系构建植物表达载体  41-44    3 讨论  44-45  第三章 GmFtsH基因的烟草转化与抗性初步分析  45-57    1 材料与方法  45-49      1.1 材料  45      1.2 主要仪器及试剂  45      1.3 农杆菌介导法转化烟草  45-47        1.3.1 受体材料准备  45        1.3.2 农杆菌的培养  45-46        1.3.3 农杆菌侵染外植体及培养  46        1.3.4 转基因烟草植株的PCR和RT-PCR的鉴定  46-47      1.4 转基因烟草的功能初步分析  47-48        1.4.1 转基因烟草抗光氧化胁迫分析  47-48        1.4.2 转基因烟草抗干旱胁迫分析  48      1.5 丙二醛(MDA)和可溶性糖含量的测定  48-49        1.5.1 MDA的提取  48        1.5.2 显色反应和测定  48        1.5.3 计算公式  48-49    2 结果与分析  49-55      2.1 转基因烟草植株的获得及分子检测(PCR、RT-PCR)  49-50        2.1.1 转基因烟草植株的获得  49        2.1.2 转基因烟草植株的分子检测  49-50      2.2 转基因烟草抗光氧化胁迫分析  50-53        2.2.1 T_0代烟草离体圆叶片的抗光氧化胁迫能力分析  50-52        2.2.2 T1代烟草连体叶片的抗光氧化胁迫能力分析  52-53      2.3 转基因烟草抗干旱胁迫分析  53-55        2.3.1 T_1代烟草在干旱条件下的萌发情况  53-54        2.3.2 T1代烟草在干旱条件下MDA含量和可溶性糖含量的变化  54-55    3 讨论  55-57全文结论  57-59参考文献  59-65附录  65-69致谢  69

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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