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新疆小麦1Dx5基因的分离克隆及表达载体构建

作　者: 鲁宵宇
导　师: 覃建兵
学　校: 新疆师范大学
专　业: 植物学
关键词: 小麦 高分子量麦谷蛋白 基因克隆 序列分析 遗传转化
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 13次
引　用: 1次
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内容摘要


小麦种子中的高分子量麦谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunit,HMW-GS）组成和数量直接影响着小麦面包烘烤品质的优劣。本文以新疆主栽春小麦（Triticun aestivum L.,AABBDD）品种新春19为实验材料,分离克隆了优质5亚基基因,并分析了它与国外面包小麦中优质5亚基基因间核酸序列、蛋白质序列以及结构差异和分子进化关系,进而构建了植物表达载体和拟南芥的遗传转化。主要研究结果如下:基因克隆与序列分析:利用PCR技术从新春19中分离克隆5亚基基因,所克隆基因命名为1Dx5-XJ19。测序结果表明:1Dx5-XJ19基因全长4658bp,编码区有2544bp,编码848个氨基酸,启动子及5’UTR有1780bp,含有启动子特征序列和增强子序列,3’端有334bp。所克隆基因与数据库中提交从国外优质面包小麦中克隆的5亚基基因,序列号为X12928相似性达到99%。由1Dx5-XJ19所推导的氨基酸序列与数据库中面包小麦氨基酸（序列号CAA31395）有两处氨基酸的替换,分别位于信号肽区和中间重复区,氨基酸中含有4个半胱氨酸,两个连续的终止子。通过对推到氨基酸二级结构预测发现β-转角含量高,结果表明所克隆基因是1Dx5优质亚基基因。植物表达载体构建:将目的基因插入表达载体pMON530 CaMV 35S启动子之后,构建植物表达载体pMON-1Dx5-XJ19,经PCR检测、酶切鉴定,插入的目的条带大小与克隆片段大小一致,均约为4.7Kb左右,表明目的基因已有效构建到表达载体中,所构建的表达载体含有CaMV 35S启动子和1Dx5-XJ19自身启动子序列。拟南芥中转化:构建含有目的基因的工程菌株GV-pMON-1Dx5-XJ19,采用花序浸泡法转化拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）,收获T0代种子播种于含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上进行抗性筛选,采用PCR技术对抗性幼苗进行检测,结果表明:1Dx5-XJ19基因已插入到拟南芥基因组中,对于目的基因能否在拟南芥种子中成功表达,表达蛋白与新春19中5亚基SDS-PAGE迁移率是否相同,有待于实验继续进行。本文的研究结果不仅为新疆农作物优质基因的操作搭建了技术平台,而且为新疆小麦品种的分子改良育种奠定了坚实的理论和应用基础。

全文目录


摘要  3-4ABSTRACT  4-71 文献综述  7-19  引言  7  1.1 小麦高分子量麦谷蛋白研究进展  7-13    1.1.1 小麦高分子量麦谷蛋白  7-10    1.1.2 HMW-GS 与小麦面包加工品质关系  10-11    1.1.3 高分子量麦谷蛋白的分离与基因克隆  11-13  1.2 我国小麦研究现状  13-17  1.3 本文研究目的、意义和内容  17-192 新疆小麦 HMW-GS 组成分析  19-27  引言  19  2.1 材料与试剂  19-21    2.1.1 实验材料  19-20    2.1.2 实验试剂  20-21  2.2 实验方法  21-22    2.2.1 小麦主要特征性状测定  21    2.2.2 种子蛋白提取及SDS-PAGE 检测  21-22  2.3 结果与分析  22-25    2.3.1 不同小麦品种主要特征特性  22-23    2.3.2 不同材料HMW-GS 组成  23-25  2.4 讨论与小结  25-273 面包烘烤品质基因1Dx5 克隆  27-52  引言  27  3.1 材料与方法  27-33    3.1.1 植物材料  27-28    3.1.2 小麦基因组的提取  28-29    3.1.3 PCR 扩增反应  29-30    3.1.4 目的片段回收  30    3.1.5 目的片段的克隆  30-31    3.1.6 质粒提取  31-32    3.1.7 质粒酶切鉴定  32    3.1.8 测序结果核酸分析  32    3.1.9 启动子序列分析  32    3.1.10 蛋白质序列分析  32-33  3.2 结果与分析  33-50    3.2.1 DNA 检测  33    3.2.2 PCR 扩增结果  33    3.2.3 重组质粒的PCR 及酶切鉴定  33-34    3.2.4 测序结果及核酸序列分析  34-38    3.2.5 蛋白质序列比较及同源关系分析  38-50  3.3 讨论与小结  50-524 1Dx5-XJ19 基因表达载体构建  52-58  引言  52  4.1 材料与方法  52-54    4.1.1 材料  52-53    4.1.2 1Dx5-XJ19 基因线性片段的制备  53    4.1.3 表达载体pMON530 制备  53-54    4.1.4 1Dx5-XJ19 基因与表达载体连接  54    4.1.5 表达载体转化及鉴定  54  4.2 结果与分析  54-56    4.2.1 1Dx5-XJ19 基因与表达载体pMON530 酶切  54-55    4.2.2 表达载体pMON-1Dx5-XJ19 的获得  55    4.2.3 表达载体pMON-1Dx5-XJ19 的检测  55-56  4.3 讨论与小结  56-585 遗传转化研究  58-66  引言  58  5.1 材料与方法  58-62    5.1.1 实验材料  58-59    5.1.2 植物材料种植  59-60    5.1.3 农杆菌感受态细胞的制备  60    5.1.4 农杆菌感受态的电击转化以及鉴定  60-61    5.1.5 花序浸泡法转化拟南芥  61    5.1.6 转基因植株的筛选  61    5.1.7 转基因植株PCR 检测  61-62  5.2 结果与分析  62-65    5.2.1 不同基质和培养方式对拟南芥生长的影响  62    5.2.2 农杆菌工程菌株构建  62-63    5.2.3 拟南芥阳性植株的筛选  63-64    5.2.4 转基因植株的PCR 检测  64-65  5.3 讨论与小结  65-66全文总结与展望  66-68英文缩略词  68-69参考文献  69-75在读期间发表的论文  75-76后记  76

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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