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红豆杉细胞遗传转化体系优化及转基因细胞株ORCA3、MET1-RNAi基因表达分析

作 者: 于小青
导 师: 付春华
学 校: 华中科技大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 红豆杉细胞 载体构建 遗传转化 紫杉醇 western blot
分类号: S791.49
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


红豆杉细胞大规模培养是最有前景的解决紫杉醇药源途径之一。红豆杉细胞培养过程中紫杉醇含量低而且极不稳定在一定程度上限制其工业化生产。随着紫杉醇生物合成途径的阐明和关键酶及转录因子的克隆,使得通过利用基因工程方法构建高产转基因细胞株成为可能。目前红豆杉细胞遗传转化体系的研究相对较少,本文对根癌农杆菌介导的红豆杉细胞遗传转化进行了系统研究,并获得了系列转基因的细胞株。主要结果如下:1)植物表达载体构建。首先从长春花和拟南芥中分别克隆到ORCA3和DNA甲级转移酶MET1基因,然后分别构建了ORCA3植物表达载体和MET1-RNAi干涉载体,并转化到土壤农杆菌EHA105菌株中。2)对根癌农杆菌介导的红豆杉细胞遗传转化体系进行优化。对影响红豆杉细胞遗传转化的主要因素,如菌液浓度、侵染时间、共培养温度和时间等进行了优化,得到最优的转化条件是:选用农杆菌菌株EHA105、以生长状态良好的曼地亚红豆杉悬浮培养细胞为受体材料、菌液光密度OD600= 0.6、侵染时间25 min、共培养最适温度21℃、共培养时间为48 h;最适的头孢霉素抑菌浓度、潮霉素筛选浓度分别为300 mg/L和8 mg/L。最优的除菌及筛选方式为:用含100 mg/L头孢霉素的无菌水冲洗10 s共培养结束的细胞材料,然后将材料转至含300 mg/L头孢霉素的抑菌培养基上,两周后转至含150 mg/L卡那霉素或8 mg/L潮霉素的筛选培养基上,筛选3个周期可获得转基因细胞株。3)转基因细胞株ORCA3基因表达分析。对筛选出的阳性细胞进行GUS组织化学活性染色、外源基因的PCR扩增检测和western blot分析,结果表明,外源目的基因已经成功整合到红豆杉基因组中,并在蛋白质水平得到表达;用HPLC法检测紫杉醇含量,发现转基因细胞株紫杉醇含量变化趋势并不相同,这可能是由插入位点的不同导致的。转基因细胞株紫杉醇的最高含量为159.3μg/g干重,为对照组的2.5倍。4)转基因细胞株MET1-RNAi载体表达分析。GUS活性染色和外源基因PCR扩增结果表明,MET1-RNAi干涉载体已成功转入红豆杉细胞染色体。转基因细胞株紫杉醇的含量都有一定程度的提高,最高含量为178.3μg/g干重,为对照组的2.87倍,说明RNAi重组表达载体在细胞内发挥了生物学作用。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
1 绪言  10-20
  1.1 课题的提出  10-11
  1.2 紫杉醇生物合成及调控研究进展  11-16
  1.3 药用植物次生代谢基因工程研究进展  16-17
  1.4 裸子植物遗传转化研究进展  17-18
  1.5 本文的研究内容及目的意义  18-20
2 材料与方法  20-33
  2.1 实验材料  20
  2.2 仪器设备及试剂  20-21
  2.3 实验原理与方法  21-33
3 结果与分析  33-56
  3.1 植物表达载体的构建  33-41
  3.2 农杆菌介导的红豆杉遗传转化体系的优化  41-48
  3.3 转基因细胞株的筛选与扩大培养  48-49
  3.4 红豆杉转基因细胞株ORCA3 的表达分析  49-53
  3.5 红豆杉转基因细胞株MET1-RNAI 干涉载体的表达分析  53-56
4 总结与展望  56-58
  4.1 总结  56-57
  4.2 展望  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-64
附录  64-67

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 针叶树类 > 红豆杉、紫杉
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