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切花菊蚜虫抗性鉴定与机理探讨及LLA转基因研究

作　者: 何俊平
导　师: 陈素梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 菊花抗虫性表皮结构抗氧化酶防御酶 LLA基因遗传转化
分类号: S682.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

菊花[Chrysanthemum grandiflorum (Ramat.) Kitamura]是我国十大传统名花、世界四大切花之一,在园林、家庭绿化美化中占有十分重要的地位。然而,菊花病虫害危害严重,蚜虫、蓟马、黑斑病、褐斑病等是其常见病虫害,在幼苗至成苗期时有发生,多危害芽心嫩尖,抑制植株的生长发育,严重影响观赏品质和应用,蚜虫不仅直接为害菊花,而且是TAV、PVP、CMV病毒的媒介者。目前,蚜虫的防治多采用化学方法,不仅消耗人力物力、造成环境污染,而且导致农药残留,使得蚜虫群体产生抗药性。因此,蚜虫的防治已成为菊花产业化生产中的一大难题,创造抗蚜虫菊花新种质已成为菊花抗性育种亟待解决的问题。目前关于切花菊抗蚜虫的研究较少,从切花菊中鉴定抗蚜虫性资源和利用转基因技术提高切花菊蚜虫抗性的研究尚未见报道。本研究旨在探讨切花菊抗蚜虫性鉴定方法,阐述蚜虫抗性机理及通过基因工程创造抗蚜虫切花菊新种质,进行了室内人工蚜虫接种的抗性鉴定,比较分析了不同蚜虫抗性品种间相关叶片结构特征、蚜虫接种后抗氧化酶与防御酶活性变化,并尝试了石蒜凝集素基因LLA转化切花菊的研究,主要研究结果如下：1.切花菊抗蚜虫性的抗性等级及不同品种的抗蚜虫性对35个切花菊品种进行了室内人工接种蚜虫的抗性鉴定研究,结果显示不同的菊花品种对蚜虫的抗性表现出明显差异,蚜虫接种21 d时各品种上虫口数量差异甚大,为0～267头不等；根据蚜量比值可将切花菊抗蚜虫性分为5级,分别为：高抗,0～0.25；中抗,0.26～0.50；抗,0.51～0.75；低抗,0.76～1.25；不抗：>1.25。其中,‘神马’、‘风车菊1’、‘南农红枫’等15个品种蚜量比值在1.25以上,为不抗品种；‘小丽’、‘韩1’、‘南农茶香’等4个品种蚜量比值为0.76～1.25,为低抗品种；‘阳光’、‘馒头菊’、‘优香’(3个品种)蚜量比值为0.51～0.75,为抗虫品种；‘韩5’、‘韩6’(2个品种)蚜量比值为0.26-0.50,为中抗品种；‘韩4’、‘南农紫勋章’、‘精云’等11个品种蚜量比值为0～0.25,为高抗品种。2.抗感切花菊品种的叶片结构特征、抗氧化酶及防御酶活性以高抗品种‘精云’、中抗品种‘韩6’和不抗品种‘神马’为材料,比较分析了三者相关叶片表面结构特征(表皮毛、腺体、蜡质等)及蚜虫接种对抗氧化酶、防御酶活性变化的影响,结果发现,‘精云’的表皮毛致密,单个表皮毛长度和高度、腺体大小及蜡质含量均高于‘韩6’和‘神马’,初步说明叶片表皮毛、腺体、蜡质含量等与切花菊抗蚜虫性具有一定的相关性；蚜虫接种后,抗氧化酶和防御酶活性水平变化均存在显著差异。在抗性品种中,超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸酶(APX)活性水平上升速度快,出现峰值较不抗品种早。APX活性变化幅度亦明显大于不抗品种。POD、POD活性在蚜虫接种后期(3d-7d)保持上升趋势。多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均有所提高,抗性品种响应快,上升幅度大,且接种后期保持较高的活性水平。说明蚜虫接种前后切花菊抗感材料叶片的活性氧系统和防御酶系统与抗虫性密切相关,可作为其苗期蚜虫抗性评价的生理指标之一。3.农杆菌介导的LLA基因转化切花菊的研究以目前生产应用比较广泛的切花菊‘神马’为材料,对其遗传转化中合适的抗生素筛选浓度进行了研究,结果表明叶片对潮霉素、羧苄青霉素十分敏感,10 mg·L-1的潮霉素能够完全抑制叶片分化,20 mg·L-1的潮霉素完全抑制了不定芽生根；确定了‘神马’叶盘再生筛选以8～10 mg·L-1的潮霉素为宜,生根筛选以18 mg·L-1的潮霉素为宜。羧苄青霉素对菊花叶片的再生有一定的抑制作用,随着浓度的升高,抑菌效果增加,但芽的分化率逐渐下降,500 mg·L-1的羧苄青霉素能够完全抑制农杆菌的滋生,但严重抑制了叶片的分化,浓度降至300 mg·L-1时,能够完全抑制农杆菌的滋生并保证50%的再生率,故确定羧苄青霉素抑菌浓度早期以500 mg·L-1为宜,后期以250～300 mg-L-1为宜。通过农杆菌介导的叶盘法将长筒石蒜凝集素LLA基因转入‘神马’,获得了105个抗性芽,生根筛选后获得54个潮霉素抗性植株；PCR及RT-PCR分子检测显示有7个株系检测到目的条带的整合与表达；对该7个转基因株系采用室内人工蚜虫接种试验进行鉴定,结果表明转基因切花菊幼苗对蚜虫密度有明显的抑制作用,且不同转化株系的抗蚜性差异较大,蚜口密度抑制率为12.2%～76.8%不等,平均蚜口密度抑制率为41.8%。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-11缩略词表 11-12第一章文献综述 12-30 1 植物抗虫性的研究进展 12-17 1.1 植物抗虫性概念 12 1.2 植物抗虫性研究的重要性与可行性 12-13 1.3 植物抗虫机制的研究 13-17 2 植物凝集素的研究进展 17-21 2.1 植物凝集素的定义 17 2.2 植物凝集素的种类 17-18 2.3 植物凝集素的性质及功能 18-20 2.4 植物凝集素在抗虫基因工程中的应用 20-21 3 菊花转基因育种的研究进展 21-27 3.1 菊花再生体系的研究 22-23 3.2 遗传转化体系的建立 23-24 3.3 菊花转基因育种研究及存在的问题 24-27 4 本研究的目的意义 27-30第二章不同切花菊品种蚜虫抗性鉴定 30-38 1 材料和方法 31-32 1.1 供试材料 31 1.2 人工蚜虫接种 31-32 1.3 蚜口数量统计与蚜虫抗性分级 32 2 结果与分析 32-35 2.1 蚜口平均数量 32-34 2.2 抗蚜性等级及抗蚜性评价 34-35 3 讨论 35-38第三章切花菊蚜虫抗性生理机理研究 38-48 1 材料与方法 39-40 1.1 植物材料 39 1.2 叶片表面结构观察 39 1.3 抗氧化酶活性的测定 39-40 1.4 防御酶活性的测定 40 2 结果与分析 40-45 2.1 叶片表面结构差异 40-42 2.2 蚜虫接种对抗感材料抗氧化酶活性的影响 42-44 2.3 蚜虫接种对抗感材料防御酶活性的影响 44-45 3 讨论 45-48 3.1 叶片表面结构特征与蚜虫抗性的关系 45-46 3.2 抗氧化酶系统与蚜虫抗性的关系 46-47 3.3 防御酶系统与蚜虫抗性的关系 47-48第四章长筒石蒜凝集素基因LLA转化切花菊的研究 48-60 1 材料与方法 49-51 1.1 材料 49 1.2 研究方法 49-51 2 结果与分析 51-58 2.1 LLA基因表达载体 51-52 2.2 不同浓度的抗生素对菊花再生和生根的影响 52-55 2.3 LLA转基因植株的获得 55-56 2.4 LLA转基因植株的分子鉴定 56 2.5 转基因植株的抗蚜性 56-58 3 讨论 58-60全文结论 60-62创新之处 62-64参考文献 64-76附录 76-82论文发表情况及参加的科研项目 82-84致谢 84

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