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蟋蟀神经肽AST系列基因串联体在苏云金芽孢杆菌中的表达

作　者: 聂智毅
导　师: 黄俊生
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 蟋蟀神经肽 AST系列基因 苏云金芽孢杆菌 cry3Aa基因 载体构建 表达 毒性
分类号: Q786
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


蟋蟀神经肽ASTs是从二点蟋蟀（Gryllus bimaculatus）脑中分离的一种保幼激素抑制素（allatostatin,AST）,体外实验显示它能强烈抑制昆虫咽侧体合成保幼激素。蟋蟀神经肽AST基因富含GC序列,共编码15个AST多肽,C末端有一共同的序列Y/FXFGL/I/V。本文主要工作就是通过构建苏云金芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭表达载体,将构建的神经肽AST系列基因导入苏云金芽孢杆菌进行表达分析,并在基因表达后利用表达产物进行虫效实验。 利用PCR的方法从携带cry3Aa基因及其启动子的苏云金芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭载体pHT305A中扩增得到cry3Aa基因的启动子及cry3Aa基因与启动子的融合片段,克隆于苏云金芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭载体pHT304中,构建成苏云金芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭表达载体pHT3AP及苏云金芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭融合表达载体pHT3AG。 AST1、AST2、AST5及AST13基因串联体连接至pHT3AP和pHT3AG的多克隆位点上导入苏云金芽孢杆菌无质粒突变株BMB171中进行表达分析,其中pHT3AG—AST2和pHT3AG—AST5能在苏云金芽孢杆菌无晶体突变株BMB171中表达目的蛋白cry3Aa—AST2和cry3Aa—AST5。比较重组质粒受体菌和空白质粒受体菌表达产物SDS-PAGE图谱,可见重组质粒受体菌比空白质粒受体菌多表达了一种蛋白,该蛋白质的分子量约93—94kD,与理论推导值94kD相近,应为目的蛋白。对cry3Aa—AST2和cry3Aa—AST5在苏云金芽孢杆菌表达系统表达的培养时间与表达量之间关系进行了研究,实验结果表明培养约60—72h受体菌中的目标蛋白量最高。 以表达的目标蛋白cry3Aa—AST2和cry3Aa—AST5对椰心叶甲进行虫效测试。把清水、pHT3AG空载体表达产物、表达了cry3Aa—AST2和cry3Aa—AST5融合蛋白的BMB171+pHT3AG-AST2和BMB171+pHT3AG-AST5通过浸叶法处理椰子树未展开的芯叶,喂食各龄椰心叶甲。从喂食表达蛋白的第二天起开始记录椰心叶甲取食量、体重和死亡数。结果表明BMB171+pHT3AG-AST2和BMB17l+pHT3AG-AST5对椰心叶甲低龄幼虫、高龄幼虫及成虫的致死效果不明显,对其食欲及生长发育也无明显影响。

全文目录


中文摘要  3-4
Abstract  4-8
第一部分 前言与文献综述  8-32
  1 昆虫神经肽  8-21
    1.1 主要神经肽种类  9-13
    1.2 昆虫神经肽保幼激素抑制素(Allatostatin，AST)研究进展  13-19
    1.3 AST在害虫防治中的应用前景  19-20
    1.4 蟋蟀神经肽Grb—ASTs系列基因串连体的研究  20-21
  2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因工程研究进展  21-28
    2.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的结构、功能及其基因分类  22-23
    2.2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的基因工程研究及应用  23-28
  3 苏云金芽孢杆菌无晶体突变株BMB171与cry3Aa基因  28-29
  4 利用苏云金芽孢杆菌表达ASTs系列基因串连体  29-30
  5 本实验的研究目的和意义  30-31
  6 本实验的技术路线  31-32
第二部分 苏云金芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭表达载体的构建与AST系列基因在苏云金芽孢杆菌中的表达  32-53
  1 材料与试剂  32
    1.1 质粒与菌种  32
    1.2 试剂  32
    1.3 引物合成与DNA测序  32
  2 苏云金芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭表达载体的构建  32-46
    2.1 cry3Aa启动子及启动子与基因的融合片段的PCR扩增及克隆  32-40
    2.2 表达载体pHT3AP与pHT3AG的构建  40-46
  3 神经肽AST系列基因串联体的表达  46-52
    3.1 神经肽AST系列基因串联体表达载体的构建  46-49
    3.2 神经肽AST系列基因串联体在BMB171中的表达  49-51
    3.3 表达产物的SDS-PAGE-  51-52
  4 抗虫实验  52-53
    4.1 实验材料  52
    4.2 实验方法  52-53
第三部分 结果与分析  53-75
  1 苏云金芽孢杆菌—大肠杆菌穿梭表达载体的构建  53-63
    1.1 cry3Aa启动子及启动子与基因融合片段的PCR扩增及克隆  55-60
    1.2 表达载体pHT3AP与pHT3AG的构建  60-63
  2 神经肽AST系列基因串联体的表达  63-73
    2.1 神经肽AST系列基因串联体表达载体的构建  63-69
    2.2 神经肽AST系列基因串联体在苏云金芽孢杆菌BMB171中的表达  69-73
  3 抗虫实验  73-75
结论  75-76
讨论  76-80
参考文献  80-90
致谢  90

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 基因的表达
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