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香蕉1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)反义基因植物表达载体的构建及转化香蕉的研究

作　者: 李瑞珍
导　师: 金志强
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 香蕉 ACC 合成酶反义基因植物表达载体遗传转化转基因植株
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

●果实特异性表达ACS cDNA的鉴定：以本研究所采用的香蕉 ACC 合成酶3’RACE产物（1680bp）作探针，分别与来自于香蕉根、叶、果皮及果肉的总RNA进行Northern狭线杂交，证实本研究所采用的确实为香蕉果实中特异性表达的ACC合成酶基因。将该基因编码区的核苷酸序列与Genebank中登录的ACC合成酶基因的相应序列进行比较，发现与MA-ACS1（AB021906）的序列同源性达99.8％，而MA-ACS1基因已被证实为与香蕉果实成熟直接相关。以反义RNA抑制该基因的表达，应能有效延缓香蕉果实的成熟。 ●全长ACS cDNA的获得：由于本研究所采用的香蕉ACC合成酶cDNA是以5’和3’RACE产物分别克隆于pGEM-T Easy Vector和pCR2.1Vector上的，利用两产物间重叠区的酶切位点，可将两产物连接成一全长的cDNA。用限制性内切酶EcoRⅠ将克隆于pGEM-T Easy Vector上的ACC合成酶基因5’端序列（667bp）切下来，克隆到中间载体pBluescript M13-Vector上构建成pBS-667；再用MfeⅠ/XbalⅠ将克隆于pCR2.1 Vector上的3’端序列（1680bb）切下来并与经过相应双酶切的pBS-667定向连接，得到带有拼接成完整香蕉ACC合成酶基因的重组质粒pBS-ACC；　●ACS反义基因植物表达载体的构建：用SalⅠ/XbaⅠ将完整基因从pBS-ACC上切下来，以相反方向（启动子3’→5’终止子）连接到带有双CaMV 35S启动子及除草剂膦丝菌素（phophinothricin PPT）抗性基因的植物中间表达载体pBBB上，经酶切鉴定，证明获得了反义基因载体pBBB-aACC。申回狲计蚀业泌誉腕、用肃狲带职业大学2001尼枷士学位快X t香蕉的遗传转化：取群型为 AAA、不同品种香蕉（巴西香蕉、红香蕉）芽的顶端分生组织与球茎薄片作受体材料，分别采用农杆菌介导法、基因枪法进行遗传转化。在诱导芽和再生根系过程中，通过PPT抗性筛选，从农杆菌介导转化过的红香蕉材料中得到64株抗性植株。经过PCR 检测其中的42株，有9株为阳性植株，初步确认为转基因植株。

全文目录

致谢  6-7
中文摘要  7-9
第一部分引言与文献综述  9-30
  1 引言  9-12
    1．1 香蕉的分类  9-10
    1．2 香蕉的生物学特性  10
    1．3 香蕉的生产状况及经济意义  10-11
    1．4 香蕉贮运过程中的保鲜  11-12
  2 乙烯与香蕉的成熟  12-19
    2．1 乙烯与果实的成熟  12-13
    2．2 乙烯生物合成的研究进展  13-15
    2．3 ACC 合成酶（ACS）与ACC氧化酶（ACO）的研究进展  15-17
    2．4 乙烯与香蕉的成熟  17-19
    2．5 乙烯信号转导的研究进展  19
  3 反义RNA技术及其在果实采后保鲜中的应用  19-22
    3．1 反义RNA的发现  20
    3．2 反义RNA的作用原理  20-21
    3．3 反义RNA技术在果实采后保鲜中的应用  21-22
  4 香蕉植株再生及遗传转化  22-28
    4．1 香蕉的植株再生体系  22-23
    4．2 香蕉的遗传转化系统  23-28
  5 本研究的目的和意义  28-29
  6 技术路线  29-30
第二部分香蕉果实成熟相关ACC合成酶基因的鉴定  30-37
  1 材料与试剂  30
  2 方法  30-34
    2．1 香蕉不同组织总RNA的提取  30-31
    2．2 Northern狭线杂交  31-34
      2．2．1 探针的标记  31-32
      2．2．2 RNA样品的制备  32
      2．2．3 预杂交及杂交  32-33
      2．2．4 洗膜及显色  33-34
  3 结果与分析  34-37
    3．1 香蕉不同组织总RNA的提取  34
    3．2 Northern狭线杂交  34
    3．3 同源性比较  34-37
第三部分 ACC合成酶反义基因植物表达载体的构建  37-46
  1 材料与试剂  39-40
  2 方法  40-44
    2．1 ACC合成酶完整基因的拼接  40-44
      2．1．1 重组质粒pBS-667的获得  40-43
      2．1．2 重组质粒pBS-ACC的获得  43-44
    2．2 反义基因载体的构建  44
  3 结果与分析  44-46
    3．1 ACC合成酶完整基因的拼接  44-45
    3．2 反义基因载体的构建  45-46
第四部分香蕉高效再生体系的建立  46-50
  1 材料与试剂  46
  2 方法  46-48
    2．1 芽增殖途径  46
    2．2 器官发生途径  46-47
    2．3 体细胞胚发生途径  47-48
  3 结果与分析  48-50
    3．1 芽增殖途径  48
    3．2 器官发生途径  48-49
    3．3 体细胞胚发生途径  49-50
第五部分香蕉的遗传转化  50-63
  1 材料与试剂  50
  2 香蕉材料的准备及抗性梯度实验  50
    2．1 香蕉材料的准备  50
    2．2 抗性梯度实验  50
  3 质粒pBBB-aACC导入农杆菌EHA105  50-52
    3．1 三亲交配法将反义载体pBBB-aACC导入农杆菌EHA105  50-51
    3．2 菌落原位杂交筛选重组子  51-52
  4 农杆菌介导法转化香蕉芽顶端分生组织及球茎薄片  52-53
    4．1 无菌受体材料的准备  52
    4．2 农杆菌的培养  52
    4．3 侵染  52-53
    4．4 共培养  53
    4．5 选择培养  53
    4．6 生根培养  53
  5 基因枪法转化香蕉顶端分生组织  53-56
    5．1 反义表达载体pBBB-aACC的大量提取及纯化  53-55
    5．2 微弹载体的制备  55
    5．3 受体材料的准备  55
    5．4 装弹  55
    5．5 轰击  55-56
    5．6 过渡培养  56
    5．7 筛选培养  56
  6 抗性植株的PCR检测  56-58
    6．1 CTAB法提取香蕉基因组DNA  56-57
    6．2 PCR扩增  57-58
    6．3 PCR产物的凝胶电泳  58
  7 结果与分析：  58-63
    7．1 香蕉材料的抗性梯度实验  58
    7．2 pBBB-aACC导入农杆菌  58-59
      7．2．1 三亲交配法将反义载体导入农杆菌EHA105  58-59
      7．2．2 菌落原位杂交筛选重组子  59
    7．3 农杆菌介导法转化香蕉芽顶端分生组织及球茎薄片  59-60
    7．4 基因枪法转化香蕉芽顶端分生组织及球茎薄片  60-61
    7．5 抗性植株的PCR检测  61-63
第六部分结论  63-64
第七部分讨论  64-67
参考文献  67-73
缩写词  73-74
英文摘要  74-75

香蕉1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)反义基因植物表达载体的构建及转化香蕉的研究

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