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rd29A驱动RdreBlBI基因转化‘红颊’草莓的研究

作　者: 王翡
导　师: 高志红
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 草毒红颊 Rd29A RdrB1BI 遗传转化抗寒鉴定
分类号: S668.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

早每(Fragaria ananassa Duch)属蔷薇科草莓属多年生草本植物,是世界上广泛栽培的重要经济果树,然而草莓不能安全越冬和耐寒品种的缺乏成为生产上的突出问题。由于草莓的栽培品种多为八倍体,遗传性状高度杂合,给常规杂交育种带来很大困难。现代基因工程直接在基因水平上改良,打破了物种间的界限,在培育抗病、抗虫、抗逆境和抗除草剂等草莓优良品种中发挥越来越重要的作用。水稻转录因子RdreB1B1是一个调控植物发育且与植物胁迫抗性相关的转录因子。已有研究证明将RdreB1BI基因转化拟南芥,拟南芥植株的抗旱性和耐寒性有很大提高。本研究的目的是用根癌农杆菌介导法将逆境诱导型启动子rd29A诱导RdreB1B1基因转化草莓品种‘红颊’,获得抗寒性较强的转基因植株,以培育抗寒草莓新种质。主要研究结果如下：1.以草莓‘明宝(Meiho)’和‘红颊(Benihope)’两个品种的叶片为外植体,研究了不同基本培养基、暗培养时间、植物生长调节剂、叶龄、放置方式对其不定芽再生的影响。结果表明：各品种叶片不定芽离体再生的最佳条件不同。‘明宝’叶片的最佳不定芽再生培养基为MS+2.5mg/L TDZ+0.1mg/L IBA+0.1mg/L2,4-D,叶片再生的最佳叶龄为30-40d,再生率可达82.8%；‘红颊’叶片的最佳不定芽再生培养基为MS+2.0mg/L TDZ+0.1mg/L IB A+0.1mg/L 2,4-D,叶片再生的最佳叶龄在10-20d,再生率可达80%。两个品种叶片暗培养14d可以提高不定芽再生率；叶片正放比反放再生效果好；添加浓度8mg/L AgN03和1000 mg/L活性炭可有效提高再生率。2.以‘红颊’草莓品种的叶片为受体,对影响遗传转化的一系列因子(潮霉素选择压、抗生素种类和浓度、农杆菌浓度、浸染时间和共培养时间)进行优化,建立了高效的遗传转化体系。优化的转化体系为：菌液浓度为OD600=0.4；侵染时间为6min；250mg/L的Cb作为抑菌抗生素,5mg/L的潮霉素作为筛选抗生素；共培养时间3天。3.为培育耐低温的草莓新种质,我们将诱导型启动子rd29A诱导RdreB1B1基因转入草莓优良品种‘红颊’中。将5株转基因植株进行分子检测,GUS染色成阳性、PCR结果显示RdreB1B基因已成功整合到5株转基因植株的基因组中；RT-PCR检测结果显示RdreB1B1基因已在这5个转基因株系中进行了转录；将转基因植株进行炼苗盆载以及利用Inverse PCR方法对其进行目的基因拷贝数检测,结果显示拷贝数1-3个不等。4.将通过GUS染色、PCR、RT-PCR和目的基因拷贝数检测的五个转基因株系进行低温处理,选出最抗寒株系检测丙二醛(MDA)、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量和超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性,结果表明,其中一个单拷贝的株系的转基因植株可以忍受-4℃低温并可以恢复正常生长,RdreB1B1基因在0℃时表达量最高。进一步研究发现导入RdreB1B.1转录因子可显著减弱MDA在植物体内的积累,提高可溶性蛋白、游离脯氨酸的含量、SOD以及CAT的活性,从而提高了转基因草莓的抗寒能力。

全文目录

摘要 6-8ABSTRACT 8-10缩略语 10-11前言 11-13第一章文献综述 13-35 1 草莓遗传转化的研究 13-21 1.1 根癌农杆菌介导法的转化机理 13-14 1.2 草莓中导入的外源目的基因 14-19 1.3 影响草莓遗传转化的主要因素 19-21 1.4 问题与展望 21 2 DREB类转录因子研究进展 21-24 2.1 DREB类转录因子 21-22 2.2 DREB的结构特点和功能 22-23 2.3 DREB转录因子的表达调控 23-24 3 逆境诱导型启动子rd29A的研究进展 24-27 3.1 rd29A的结构特点和功能 24-25 3.2 rd29A启动子的应用 25-27 参考文献 27-35第二章草莓高效离体叶片再生体系的建立 35-45 1 材料与方法 35-37 1.1 材料 35-36 1.2 方法 36-37 1.3 评价指标与数据调查 37 2 结果与分析 37-41 2.1 不同基本培养基对草莓叶片不定芽再生的影响 37 2.2 暗培养时间对草莓叶片不定芽再生的影响 37-38 2.3 不同植物生长调节剂组合对草莓叶片不定芽再生的影响 38-40 2.4 叶龄对草莓叶片不定芽再生的影响 40 2.5 叶片放置方式对草莓叶片不定芽再生的影响 40 2.6 添加AgNO_3和活性炭对草莓叶片不定芽再生的影响 40-41 3 讨论 41-43 参考文献 43-45第三章根癌农杆菌介导‘红颊’草莓遗传转化体系的研究 45-55 1 材料与方法 45-48 1.1 转化受体植物材料 45 1.2 供试菌株 45-46 1.3 培养基以及培养条件 46 1.4 方法 46-48 2 结果与分析 48-51 3 讨论 51-53 参考文献 53-55第四章转RdreB1BI基因草莓植株的分子检测 55-67 1 材料与方法 55-60 2 结果与分析 60-63 3 讨论 63-65 参考文献 65-67第五章转RdreB1BI基因草莓植株的抗寒性鉴定 67-83 1 材料与方法 67-72 1.1 材料 67 1.2 方法 67-71 1.3 转基因植株中RdreB1BI基因相对表达量分析 71-72 2 结果与分析 72-78 2.1 低温处理表型分析 72-73 2.2 抗寒指标的测定 73-77 2.3 转基因植株中RdreB1BI基因相对表达量分析 77-78 3 讨论 78-80 参考文献 80-83全文结论 83-85主要创新点 85-87附录 87-89攻读硕士学位期间所发表论文 89-91致谢 91

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