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rd29A驱动RdreBlBI基因转化‘红颊’草莓的研究

作 者: 王翡
导 师: 高志红
学 校: 南京农业大学
专 业: 果树学
关键词: 草毒 红颊 Rd29A RdrB1BI 遗传转化 抗寒鉴定
分类号: S668.4
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


早每(Fragaria ananassa Duch)属蔷薇科草莓属多年生草本植物,是世界上广泛栽培的重要经济果树,然而草莓不能安全越冬和耐寒品种的缺乏成为生产上的突出问题。由于草莓的栽培品种多为八倍体,遗传性状高度杂合,给常规杂交育种带来很大困难。现代基因工程直接在基因水平上改良,打破了物种间的界限,在培育抗病、抗虫、抗逆境和抗除草剂等草莓优良品种中发挥越来越重要的作用。水稻转录因子RdreB1B1是一个调控植物发育且与植物胁迫抗性相关的转录因子。已有研究证明将RdreB1BI基因转化拟南芥,拟南芥植株的抗旱性和耐寒性有很大提高。本研究的目的是用根癌农杆菌介导法将逆境诱导型启动子rd29A诱导RdreB1B1基因转化草莓品种‘红颊’,获得抗寒性较强的转基因植株,以培育抗寒草莓新种质。主要研究结果如下:1.以草莓‘明宝(Meiho)’和‘红颊(Benihope)’两个品种的叶片为外植体,研究了不同基本培养基、暗培养时间、植物生长调节剂、叶龄、放置方式对其不定芽再生的影响。结果表明:各品种叶片不定芽离体再生的最佳条件不同。‘明宝’叶片的最佳不定芽再生培养基为MS+2.5mg/L TDZ+0.1mg/L IBA+0.1mg/L2,4-D,叶片再生的最佳叶龄为30-40d,再生率可达82.8%;‘红颊’叶片的最佳不定芽再生培养基为MS+2.0mg/L TDZ+0.1mg/L IB A+0.1mg/L 2,4-D,叶片再生的最佳叶龄在10-20d,再生率可达80%。两个品种叶片暗培养14d可以提高不定芽再生率;叶片正放比反放再生效果好;添加浓度8mg/L AgN03和1000 mg/L活性炭可有效提高再生率。2.以‘红颊’草莓品种的叶片为受体,对影响遗传转化的一系列因子(潮霉素选择压、抗生素种类和浓度、农杆菌浓度、浸染时间和共培养时间)进行优化,建立了高效的遗传转化体系。优化的转化体系为:菌液浓度为OD600=0.4;侵染时间为6min;250mg/L的Cb作为抑菌抗生素,5mg/L的潮霉素作为筛选抗生素;共培养时间3天。3.为培育耐低温的草莓新种质,我们将诱导型启动子rd29A诱导RdreB1B1基因转入草莓优良品种‘红颊’中。将5株转基因植株进行分子检测,GUS染色成阳性、PCR结果显示RdreB1B基因已成功整合到5株转基因植株的基因组中;RT-PCR检测结果显示RdreB1B1基因已在这5个转基因株系中进行了转录;将转基因植株进行炼苗盆载以及利用Inverse PCR方法对其进行目的基因拷贝数检测,结果显示拷贝数1-3个不等。4.将通过GUS染色、PCR、RT-PCR和目的基因拷贝数检测的五个转基因株系进行低温处理,选出最抗寒株系检测丙二醛(MDA)、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量和超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性,结果表明,其中一个单拷贝的株系的转基因植株可以忍受-4℃低温并可以恢复正常生长,RdreB1B1基因在0℃时表达量最高。进一步研究发现导入RdreB1B.1转录因子可显著减弱MDA在植物体内的积累,提高可溶性蛋白、游离脯氨酸的含量、SOD以及CAT的活性,从而提高了转基因草莓的抗寒能力。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10缩略语  10-11前言  11-13第一章 文献综述  13-35  1 草莓遗传转化的研究  13-21    1.1 根癌农杆菌介导法的转化机理  13-14    1.2 草莓中导入的外源目的基因  14-19    1.3 影响草莓遗传转化的主要因素  19-21    1.4 问题与展望  21  2 DREB类转录因子研究进展  21-24    2.1 DREB类转录因子  21-22    2.2 DREB的结构特点和功能  22-23    2.3 DREB转录因子的表达调控  23-24  3 逆境诱导型启动子rd29A的研究进展  24-27    3.1 rd29A的结构特点和功能  24-25    3.2 rd29A启动子的应用  25-27  参考文献  27-35第二章 草莓高效离体叶片再生体系的建立  35-45  1 材料与方法  35-37    1.1 材料  35-36    1.2 方法  36-37    1.3 评价指标与数据调查  37  2 结果与分析  37-41    2.1 不同基本培养基对草莓叶片不定芽再生的影响  37    2.2 暗培养时间对草莓叶片不定芽再生的影响  37-38    2.3 不同植物生长调节剂组合对草莓叶片不定芽再生的影响  38-40    2.4 叶龄对草莓叶片不定芽再生的影响  40    2.5 叶片放置方式对草莓叶片不定芽再生的影响  40    2.6 添加AgNO_3和活性炭对草莓叶片不定芽再生的影响  40-41  3 讨论  41-43  参考文献  43-45第三章 根癌农杆菌介导‘红颊’草莓遗传转化体系的研究  45-55  1 材料与方法  45-48    1.1 转化受体植物材料  45    1.2 供试菌株  45-46    1.3 培养基以及培养条件  46    1.4 方法  46-48  2 结果与分析  48-51  3 讨论  51-53  参考文献  53-55第四章 转RdreB1BI基因草莓植株的分子检测  55-67  1 材料与方法  55-60  2 结果与分析  60-63  3 讨论  63-65  参考文献  65-67第五章 转RdreB1BI基因草莓植株的抗寒性鉴定  67-83  1 材料与方法  67-72    1.1 材料  67    1.2 方法  67-71    1.3 转基因植株中RdreB1BI基因相对表达量分析  71-72  2 结果与分析  72-78    2.1 低温处理表型分析  72-73    2.2 抗寒指标的测定  73-77    2.3 转基因植株中RdreB1BI基因相对表达量分析  77-78  3 讨论  78-80  参考文献  80-83全文结论  83-85主要创新点  85-87附录  87-89攻读硕士学位期间所发表论文  89-91致谢  91

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 多年生草本果类 > 草莓
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