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龙眼体胚发生系统的优化及其在种质保存与遗传转化上的应用

作　者: 徐清锋
导　师: 赖钟雄
学　校: 福建农林大学
专　业: 果树学
关键词: 龙眼 胚性愈伤组织 限制生长保存 体胚发生 农杆菌介导 ACS反义基因 抗性愈伤组织
分类号: S667.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是我国南方大面积种植的重要热带亚热带果树。本研究主要以长期保存的龙眼胚性培养物为材料,对以下6个方面进行研究:①对三种类型龙眼EC进行限制生长保存条件的优化;②17个龙眼品种的体胚发生以及植株再生;③选择并优化龙眼愈伤组织转基因受体系统;④采用根癌农杆菌介导法进行ACS反义基因转化龙眼并优化转化体系;⑤对抗性龙眼EC进行筛选并进行其生长状况观察;⑥对转ACS反义基因的抗性EC进行GUS稳定表达检测和GUS基因的PCR检测。主要研究结果如下:1三种类型龙眼胚性愈伤组织限制生长保存条件优化试验比较了不同浓度山梨醇、甘露醇、PEG、肌醇、麦芽糖以及光质的差异对三种类型龙眼胚性EC生长的影响,并对上述三种类型龙眼EC最佳保存条件进行验证。试验结果表明: CⅢI和CⅡa两种类型的龙眼EC在相应的培养基中可以将其保存时间延长到60d,CⅡb也能够将其保存时间延长到50d,并且能够保持旺盛的生长及再生能力。2 17个龙眼品种的体胚发生和植株再生为检测长期限制性离体保存的龙眼EC的体胚发生能力,试验以尚未完成植株再生的17个龙眼胚性愈伤组织为材料,对其进行体胚诱导、成熟以及植株再生的相关研究,与此同时本试验的完成标志着所有长期限制性保存的龙眼EC均实现植株再生。试验结果表明,龙眼品种的差异对体胚发生和植株再生有一定的影响。对17个龙眼品种进行体胚诱导的结果表明:不同品种、不同麦芽糖浓度、甘露醇浓度、PEG浓度对体胚出现时间、胚状体数量以及质量都具有一定的影响,体胚出现时间一般在15-35d,形成胚状体的数量从大约在1080-14380个?g,分化频率为100%,颜色多为白色小子叶胚;对17个龙眼品种进行体胚成熟的研究表明:不同龙眼品种、不同比例的蔗糖和麦芽糖、不同高渗试剂、干燥处理对胚状体的大小、形态以及褐化情况都有一定的影响,其中胚状体大小在5-15mm不等,多白色增大;对17个龙眼品种进行植株再生的研究表明:不同龙眼品种、不同胚状体都对体胚萌发时间、体胚萌发率以及体胚再生苗的长势有一定的影响,萌发率也存在着一定的差异一般在从35.67%-90.00%不等,正常成熟体胚的萌发时间最早在13 d左右就萌发,最晚需要20 d才能萌发。3选择并优化龙眼愈伤组织转基因受体系统由于愈伤组织受体系统具有较强的分化和再生能力,遗传稳定性良好。试验以红核子的愈伤组织作为根癌农杆菌介导ACS反义基因转化龙眼的受体系统。通过对龙眼EC进行生长量的测定,发现在继代培养15 d左右的龙眼EC其生长速度最快,生活力最强,最适宜作为转基因的受体材料;试验过程中采用生长量测定和定性观察相结合的方法,试验发现100 mg·L-1卡那霉素浓度适合于龙眼愈伤组织进行转化操作的筛选抗生素浓度,而头孢霉素浓度范围在0-400 mg·L-1时,对愈伤组织的正常生长和再生均无较大影响。4农杆菌介导的ACS反义基因转化龙眼本试验在上述研究的基础上,对农杆菌介导的龙眼受体系统的遗传转化策略进行研究。试验结果表明,高效稳定的转化条件为将龙眼受体材料在转化前置于0.15mol·L-1的液态甘露醇中6 h,农杆菌在1/2 MS附加葡萄糖浓度80 g·L-1的重悬液中,将菌液的浓度稀释成0.9(OD600),受体材料侵染30 min,洗菌后在共培养基pH为5.6,温度为22℃时进行共培养5-6 d。在对最佳转化条件的验证试验中我们发现,以上述条件进行遗传转化可获得GUS瞬时表达率达90%以上的龙眼抗性EC,经过后期筛选本试验得到龙眼抗性EC 55份。5筛选和观察抗性EC以及GUS基因的分子检测对转化ACS反义基因的龙眼抗性EC进行筛选及观察,并对前期抗性EC进行GUS瞬时表达检测、后期抗性EC的GUS基因的PCR检测。试验采用逐步加压法作为抗性EC的筛选方法,其最终以附加100 mg﹒L-1卡那霉素、1 mg﹒L-1 2,4-D以及0.5 mg﹒L-1NAA的筛选培养基对共培养后的龙眼EC进行筛选,用DNA微量提取法对抗性EC进行PCR检测,结果表明GUS基因已整合进龙眼基因组。但是龙眼的抗性EC生长较为缓慢,体胚发生能力较差。

全文目录


摘要  14-16
ABSTRACT  16-19
第一章 引言  19-37
  1 植物体胚发生研究进展  19-23
    1.1 体胚发生的主要途径  19-20
    1.2 植物体胚发生体系的建立  20-21
      1.2.1 胚性愈伤组织的诱导与筛选  20
      1.2.2 体胚的诱导与成熟  20-21
      1.2.3 体胚的萌发与成苗  21
    1.3 植物体胚发生的主要影响因素  21-23
      1.3.1 体胚发生的内在影响因素  21
      1.3.2 体胚发生的外在影响因素  21-23
  2 植物种质资源离体保存研究进展  23-25
    2.1 植物种质资源离体保存的必要性  23
    2.2 植物种质资源离体保存的方法  23-25
      2.2.1 限制生长保存方法  23-25
      2.2.2 超低温保存法  25
  3 果树遗传转化的研究进展  25-31
    3.1 果树遗传转化的研究概况  25-26
    3.2 果树遗传转化的应用  26-29
      3.2.1 调节果实的成熟及保鲜方面上的应用  26
      3.2.2 果树抗病虫方面上的应用  26-27
      3.2.3 果树抗逆性方面上的应用  27
      3.2.4 果树抗除草剂方面上的应用  27-29
    3.3 果树遗传转化中存在的问题与解决途径  29-31
      3.3.1 加强对有应用价值的外源目的基因的研究开发  29-30
      3.3.2 提高果树遗传转化的成功率  30
      3.3.3 外源基因在果树中的定量表达和稳定调控  30
      3.3.4 果树基因工程所引发的生物安全性问题  30-31
  4 龙眼生物技术研究进展  31-33
    4.1 龙眼离体器官发生及胚性愈伤组织的诱导  32
    4.2 龙眼高频率体胚发生与植株再生  32
    4.3 龙眼基因工程研究进展  32-33
  5 ACS 基因研究进展  33-35
    5.1 ACS 基因的生物学功能  33
    5.2 ACS 基因在植物中的克隆  33-34
    5.3 ACS 基因在植物遗传研究中的应用  34-35
  6 本研究的内容与意义  35-37
    6.1 本研究主要内容  35-36
    6.2 本研究意义  36-37
第二章 不同类型龙眼EC 限制生长保存条件优化  37-48
  1 材料与方法  37-39
    1.1 材料  37
    1.2 方法  37-39
      1.2.1 不同浓度山梨醇、甘露醇对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  37-38
      1.2.2 不同浓度PEG 对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  38
      1.2.3 不同浓度肌醇对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  38-39
      1.2.4 蔗糖和麦芽糖的配比对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  39
      1.2.5 不同光质对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  39
      1.2.6 三种类型龙眼EC 最佳保存条件的验证  39
  2 结果与分析  39-45
    2.1 不同浓度山梨醇、甘露醇对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  39-40
    2.2 不同浓度PEG 对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  40-42
    2.3 不同浓度肌醇对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  42-43
    2.4 不同蔗糖和麦芽糖的配比对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  43-44
    2.5 不同光质对三种类型龙眼EC 限制性生长的影响  44
    2.6 三种类型龙眼EC 最佳保存时间的验证  44-45
  3 讨论  45-48
    3.1 山梨醇、甘露醇在三种类型龙眼EC 离体种质保存中的作用  45-46
    3.2 PEG 在三种类型龙眼EC 离体种质保存中的作用  46
    3.3 肌醇在三种类型龙眼EC 离体种质保存中的作用  46
    3.4 麦芽糖在三种类型龙眼EC 离体种质保存中的作用  46
    3.5 光质在三种类型龙眼EC 离体种质保存中的作用  46-47
    3.6 三种类型龙眼EC 最佳保存时间的验证  47-48
第三章 17 个龙眼品种离体保存胚性愈伤组织的体胚发生与植株再生  48-60
  1 材料与方法  48-50
    1.1 材料  48
    1.2 方法  48-50
      1.2.1 龙眼胚性愈伤组织的体胚诱导  48-49
      1.2.2 龙眼的体胚成熟  49-50
      1.2.3 龙眼体胚的萌发与植株再生  50
      1.2.4 不同的移栽季节对植株再生的影响  50
  2 结果与分析  50-58
    2.1 龙眼胚性愈伤组织的体胚诱导  50-53
      2.1.1 不同品种（基因型）对体胚诱导的影响  50
      2.1.2 麦芽糖浓度对体胚诱导的影响  50-52
      2.1.3 甘露醇浓度对龙眼体胚诱导的影响  52
      2.1.4 PEG 对体胚诱导的影响  52-53
    2.2 龙眼体胚的成熟  53-56
      2.2.1 不同品种（基因型）对体胚成熟的影响  53
      2.2.2 不同比例的蔗糖和麦芽糖对体胚成熟的影响  53-54
      2.2.3 不同高渗试剂对体胚成熟的影响  54-55
      2.2.4 干燥处理对体胚成熟的影响  55-56
    2.3 龙眼的体胚萌发与植株再生  56-57
      2.3.1 17 个龙眼品种（基因型）对体胚萌发的影响  56-57
      2.3.2 不同胚状体对体胚萌发的影响  57
    2.4 不同的移栽季节对植株再生的影响  57-58
  3 讨论  58-60
    3.1 龙眼体胚诱导中的影响因素  58
    3.2 龙眼体胚成熟过程中的影响因素  58-59
    3.3 龙眼体胚萌发与试管苗移栽成活的关键因素  59
    3.4 不同基因型龙眼体胚发生的差异  59-60
第四章 龙眼遗传转化受体系统的建立及优化  60-71
  1 材料与方法  60-63
    1.1 材料  60-61
      1.1.1 试剂材料  60-61
      1.1.2 植物材料  61
    1.2 方法  61-63
      1.2.1 龙眼EC 鲜重增长率的测定方法  61
      1.2.2 2,4-D 浓度对龙眼EC 鲜重增长率的影响  61
      1.2.3 不同龙眼EC 对根癌农杆菌的敏感性  61
      1.2.4 根癌农杆菌的继代保存  61
      1.2.5 抗生素的配置  61-62
      1.2.6 龙眼EC 对抗生素的耐受性  62
      1.2.7 GUS 组织化学法检测  62-63
  2 结果与分析  63-68
    2.1 龙眼EC 生长规律  63-65
      2.1.1 不同保存时间下的龙眼EC 生长规律  63-65
      2.1.2 不同2,4-D 浓度继代培养基中龙眼EC 鲜重增长率比较  65
    2.2 不同龙眼EC 对根癌农杆菌的敏感性  65-66
    2.3 不同龙眼EC 对卡那霉素的耐受性  66
    2.4 不同龙眼EC 对头孢霉素的耐受性  66-68
    2.5 三个品种龙眼EC 细胞生活力检测  68
  3 讨论  68-71
    3.1 龙眼转基因受体EC 优化的必要性  68-69
    3.2 龙眼转基因受体EC 优化的选择  69
    3.3 龙眼EC 分裂生长的内起源成为限制遗传转化的主要因素  69-70
    3.4 龙眼遗传转化中抗生素的选择  70-71
第五章 农杆菌介导ACS 反义基因转化龙眼EC  71-90
  1 材料与方法  71-74
    1.1 材料  71
    1.2 方法  71-74
      1.2.1 农杆菌对头孢霉素的耐性验证  71
      1.2.2 农杆菌浸染受体材料  71-72
      1.2.3 龙眼EC 的共培养  72
      1.2.4 龙眼EC 的共培养后的除菌  72
      1.2.5 龙眼EC 的抗性筛选  72
      1.2.6 农杆菌介导转化龙眼愈伤组织主要影响因子研究  72-74
  2 结果与分析  74-85
    2.1 农杆菌对头孢霉素的耐受性验证  74
    2.2 农杆菌介导龙眼EC 遗传转化的主要影响因子  74-85
      2.2.1 不同基因型对GUS 瞬时表达的影响  74-75
      2.2.2 受体材料预培养时间对GUS 瞬时表达的影响  75
      2.2.3 受体材料前处理对GUS 瞬时表达的影响  75-76
      2.2.4 高渗培养基的物理状态和浓度对GUS 瞬时表达的影响  76-77
      2.2.5 不同农杆菌稀释液对GUS 瞬时表达的影响  77-78
      2.2.6 农杆菌菌液浓度对GUS 瞬时表达的影响  78
      2.2.7 糖种类及浓度对GUS 瞬时表达的影响  78-79
      2.2.8 农杆菌侵染时间对GUS 瞬时表达的影响  79-80
      2.2.9 共培养时间的选择  80-81
      2.2.10 农杆菌活化物对GUS 瞬时表达的影响  81
      2.2.11 共培养温度对GUS 瞬时表达的影响  81-82
      2.2.12 共培养的pH 对GUS 瞬时表达率的影响  82-83
      2.2.13 共培养培养基中添加物对GUS 瞬时表达的影响  83
      2.2.14 共培养培养基中平铺滤纸对GUS 瞬时表达的影响  83-84
      2.2.15 最优条件下不同2,4-D 处理的愈伤组织对GUS 瞬时表达的影响  84
      2.2.16 龙眼EC 最优遗传转化条件验证  84-85
  3 讨论  85-90
    3.1 农杆菌介导龙眼EC 遗传转化中各参数优化的必要性  85-86
    3.2 预培养与前处理在龙眼遗传转化中的作用  86
    3.3 菌液浓度和侵染时间是影响龙眼转化成败的关键  86-87
    3.4 共培养时间的确定是遗传转化过程中的关键环节之一  87
    3.5 共培养的适宜的温度和 pH 有利于转化率的提高  87-88
    3.6 糖能明显提高龙眼EC 的转化效率  88
    3.7 受体材料的基因型以及生理状态是提高化率的前提  88-89
    3.8 根癌农杆菌介导龙眼EC 遗传转化存在的问题及展望  89-90
第六章 抗性愈伤组织的筛选与检测  90-97
  1 材料与方法  90-94
    1.1 材料  90-91
      1.1.1 植物材料  90
      1.1.2 试验设备  90
      1.1.3 试验试剂  90
      1.1.4 农杆菌培养基  90-91
    1.2 方法  91-94
      1.2.1 抗性愈伤组织的筛选培养  91
      1.2.2 抗性愈伤组织的继代增殖  91
      1.2.3 抗性愈伤组织的GUS 组织化学法检测  91
      1.2.4 抗性愈伤组织GUS 基因的PCR 检测  91-94
  2 结果与分析  94-95
    2.1 不同筛选方式对龙眼抗性EC 筛选效果的影响  94
    2.2 龙眼抗性EC 的组织化学法检测  94
    2.3 龙眼抗性EC 的PCR 检测  94-95
  3 讨论  95-97
    3.1 抗性愈伤筛选过程中的生长缓慢问题  95
    3.2 抗性转化体的筛选方式及筛选时期的重要性  95-96
    3.3 遗传转化中基因沉默现象的解释  96
    3.4 优化DNA 微量提取法的必要性  96
    3.5 关于试验未获的转基因植株的说明  96-97
第七章 小 结  97-100
  1 不同类型龙眼EC 限制生长保存条件优化  97
  2 17 个龙眼品种的体胚发生和植株再生  97-98
  3 龙眼转基因受体系统的建立及优化  98
  4 农杆菌介导ACS 反义基因转化龙眼EC  98-99
  5 抗性愈伤组织的筛选与检测  99-100
参考文献  100-113
附录 图版及其说明  113-128
在学硕士期间发表论文与参加学术会议  128-129
致谢  129

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 热带及亚热带果类 > 龙眼（桂圆）
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