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根癌农杆菌介导几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因转入甘蓝型油菜

作　者: 陆万香
导　师: 李名扬；裴炎
学　校: 西南农业大学
专　业: 植物学
关键词: 甘蓝型油菜根癌农杆菌玉米几丁质酶基因大麦β-1 3葡聚糖酶基因遗传转化
分类号: S565.403.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
下　载: 174次
引　用: 3次
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内容摘要

甘蓝型油菜是世界重要的经济作物之一，但是由于长期受到多种病害特别是菌核病的危害，其产量和品质受到严重影响。目前，通过常规育种方式来寻找合适的抗源尚存在困难。因此，利用植物基因工程，转入外源抗真菌基因使油菜获得对菌核病的抗性无疑成为油菜抗病育种的一条可行的新途径。本实验是在建立甘蓝型油菜下胚轴高频再生体系和成熟的遗传转化体系的基础上，利用根癌农杆菌介导的方法，将玉米几丁质酶基因、大麦β-1，3葡聚糖酶基因及其双价表达载体分别导入油菜，并对转基因植株进行了检测。实验结果如下： 1．建立起以高频再生体系取6d苗龄的下胚轴切段，接入MS+0.2mg/L BA+1.0mg/L2，4-D中预培养3～4d，再转入MS+3.0mg/L BA+0.1mg/L NAA+6mg/L AgNO₃分化培养，50d后下胚轴再生出不定芽。D₂和96V44两个品种再生频率达80％以上。 2．建立起以下胚轴为受体的遗传转化体系取各转化受体接入预培养基上培养3d，然后采用OD₆₀₀值为0.3～0.4的农杆菌菌液迅速浸染30sec，取出外植体，置灭菌滤纸上吸干多余的菌液，转入表面附加有一层滤纸的预培养基上26℃、暗处共培养2d。完成共培养后，将外植体转入MS+500mg/LCef液体培养基中，轻微振荡洗涤2～3次后滤纸吸干，接入脱菌培养基中培养7d。然后依次转入分别附加5、10、15mg/L Kan的筛选培养基中进行梯度筛选，将最终筛选到的绿芽进行检测和扩繁。四个品种的下胚轴转化率在1.6～8.4％之间。 3．转基因植株的检测分别对几丁质酶基因、葡聚糖酶基因和双价表达载体的Kan抗性芽进行PCR分子生物学检测，结果表明目的基因已随NPTⅡ基因转入油菜。分别取几丁质酶基因和双价表达载体转化植株的叶片制备粗酶液，通过化学检测法和几丁质平板检测法显示：转基因植株叶片中几丁质酶的产量比对照（非转基因植株）高，说明外源基因已在转基因植株中进行表达。取几丁质酶基因转化植株的两个株系进行室内菌核菌的接种实验，结果表明：其中一个株系与对照相比具有较强的抗性，适宜于进一步田间鉴定，以筛选出有前途的抗菌核病的油菜新材料。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-7
文献综述  7-17
  1 植物抗真菌基因工程的研究策略  8-10
  2 几丁质酶与β-1，3葡聚糖酶在植物抗真菌基因工程中的研究与应用  10-15
  3 油菜基因工程研究进展  15-17
引言  17-18
材料和方法  18-25
  1 材料  18-20
  2 方法  20-25
结果与分析  25-43
  1 再生体系的建立  25-30
  2 遗传转化体系的建立  30-36
  3 转基因植株的生根与移栽  36-37
  4 转基因植株的检测  37-43
讨论  43-48
  1 外源激素对再生的影响  43
  2 再生植株的细胞起源对外植体的选择及转化的影响  43-44
  3 过敏反应的处理方式对遗传转化的影响  44-45
  4 转化子的筛选方式  45-46
  5 转基因植株外源基因体外表达的检测  46
  6 转基因植株的抗病鉴定  46-48
小结  48-49
参考文献  49-54
缩略语  54-55
致谢  55

根癌农杆菌介导几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因转入甘蓝型油菜

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