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产内切葡聚糖酶芽孢杆菌C-36筛选及基因克隆、序列分析

作　者: 高凤菊
导　师: 陈惠
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因克隆序列分析
分类号: Q939.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 214次
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内容摘要

以羧甲基纤维素钠为唯一碳源，从废泥浆中经反复筛选及刚果红鉴定，获得一株高活力产内切葡聚糖酶芽孢杆菌。经研究发现，在培养20h后，显微镜下，经革兰氏染色为阳性。细胞杆状，细胞大小(2.2～3.0)um×(0.8～0.9)um，有芽孢，中生或近中央生，芽孢大小(1.1～1.4)um×(0.8～0.9)um，卵圆形或柱形，孢囊不膨大。细胞成对或成链，具圆端，运动性较强。将此菌株C-36与枯草芽孢杆菌标准菌株ZW-1进行了参比试验，初步鉴定该细菌为枯草芽孢杆菌。在CMC-Na平板上菌落呈乳白色，粘稠厚重，湿润光亮，生长迅速，24h可见明显透明圈。生长条件的测定显示该菌生长pH范围较宽，在pH7.0生长最好，在pH8.0～9.0的碱性条件下长势较好。摇瓶发酵粗酶液的性质测定表明，该菌所产生的内切酶在pH6.8左右酶活最高，酶活力为79.2U／mL。在pH9.0时仍能保持最高酶活力的65％以上。酶反应的适宜温度为50℃，适宜中性至碱性。根据国际基因库(GenBank)中注册的内切葡聚糖酶基因序列设计了引物，通过对内切葡聚糖酶基因PCR扩增反应条件的优化，获得了一条长约1.5kb的特异性PCR扩增条带，并对其进行了菌落PCR鉴定。然后将PCR扩增片断克隆到pMD18-T质粒中，构建含有目的基因片断的克隆质粒，并转化到JM109株大肠杆菌载体中，筛选获得阳性克隆菌株。克隆质粒中外源片断的DNA序列测定表明，该片断含有内切葡聚糖酶基因的完整序列，内切葡聚糖酶基因全长1500bp，编码499个氨基酸。将B．subtilis C-36内切葡聚糖酶基因序列在GenBank中登陆，登陆号为DQ782954。枯草芽孢杆菌C-36与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因(序列号为：Z29076.1，X04689.1，AY044252.1，X67044.1，AY766381.1)的同源性高达90％～93％，编码的氨基酸序列(序列号为：CAA82317，CAA97610，AAK94871，AAZ22322，AAN07019)同源性高达90％～98％。利用在线生物信息学数据库及生物软件对本基因进行信号肽序列、N-端糖基化位点、密码子的偏爱性等分析，并对其二级结构和三维结构进行了预测。

全文目录

独创性声明  3-4
中文摘要  4-5
英文摘要  5-10
第一章文献综述  10-20
  1 引言  10-18
    1.1 纤维素  10-11
    1.2 纤维素酶产生微生物  11-13
      1.2.1 纤维降解细菌  12
      1.2.2 纤维降解真菌  12-13
    1.3 纤维素酶系的组成分类  13
    1.4 纤维素酶的分子结构及功能  13-15
      1.4.1 催化结构域  13-14
      1.4.2 结合结构域  14
      1.4.3 连接桥  14
      1.4.4 真菌和细菌产生纤维素酶分子的主要差异  14-15
    1.5 产纤维素酶微生物菌种选育研究进展  15
    1.6 内切葡聚糖酶的分子生物学研究  15-17
    1.7 纤维素酶的应用  17-18
  2 研究目的及意义  18-20
第二章产内切葡聚糖酶芽孢杆菌C-36筛选及鉴定  20-32
  1 引言  20
  2 材料与方法  20-26
    2.1 材料  20-22
      2.1.1 样品的采集  20
      2.1.2 枯草芽孢杆菌标准菌种  20
      2.1.3 试剂  20-21
      2.1.4 主要实验设备  21
      2.1.5 培养基  21-22
    2.2 方法  22-26
      2.2.1 初筛  22
      2.2.2 刚果红染色鉴定法  22
      2.2.3 摇瓶复筛  22
      2.2.4 酶活力的测定  22-23
      2.2.5 菌株最适生长pH的测定  23
      2.2.6 菌株鉴定方法  23-26
  3 结果  26-30
    3.1 菌株的分离、初筛  26
    3.2 产内切葡聚糖酶细菌的鉴定  26-27
    3.3 摇瓶复筛  27-28
    3.4 C-36菌株最适生长pH的测定  28
    3.5 菌株的鉴定  28-30
      3.5.1 个体形态特征  28
      3.5.2 群体形态特征  28
      3.5.3 生理生化特征  28-30
  4 讨论  30-31
    4.1 关于菌种筛选  30
    4.2 关于纤维素酶活性测定  30
    4.2 关于纤维素酶活性测定  30-31
  结论  31-32
第三章枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因克隆及序列分析  32-59
  1 引言  32
  2 材料与方法  32-39
    2.1 材料  32-35
      2.1.1 菌种与质粒  32-33
      2.1.2 培养基  33
      2.1.3 试剂  33
      2.1.4 常用试剂的配制  33-35
      2.1.5 主要实验设备  35
    2.2 方法  35-39
      2.2.1 枯草芽孢杆菌C-36的DNA提取  35
      2.2.2 枯草芽孢杆菌内切纤维素酶基因的PCR扩增  35-36
      2.2.3 枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆  36-38
      2.2.4 阳性克隆菌株的筛选与鉴定  38
      2.2.5 克隆片段的DNA序列测定及分析  38-39
      2.2.6 枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因的生物信息学预测  39
  3 结果  39-57
    3.1 枯草芽孢杆菌DNA提取  39
    3.2 纤维素酶基因PCR扩增结果  39-40
    3.3 阳性克隆菌株的筛选与鉴定  40-41
      3.3.1 阳性克隆菌株的筛选  40
      3.3.2 阳性克隆菌株的鉴定  40-41
    3.4 克隆片段的DNA序列测定及同源性分析  41-49
      3.4.1 枯草芽孢杆菌C-36与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因的序列比较  41-47
      3.4.2 枯草芽孢杆菌C-36与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶的氨基酸序列比较  47-49
    3.5 枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因的生物信息学分析  49-57
      3.5.1 枯草芽孢杆菌C-36菌株内切葡聚糖酶的信号肽切割位点分析  49-51
      3.5.2 枯草芽孢杆菌C-6菌株内切葡聚糖酶成熟蛋白序列的糖基化分析  51-52
      3.5.3 枯草芽孢杆菌C-36株内切葡聚糖酶成熟蛋白编码区的密码子使用频率统计  52-54
      3.3.4 枯草芽孢杆菌C-36株内切葡聚糖酶成熟蛋白的氨基酸分析  54-55
      3.5.5 枯草芽孢杆菌C-36株内切葡聚糖酶成熟蛋白的二级结构预测分析  55-56
      3.5.6 枯草芽孢杆菌C-36株内切葡聚糖酶成熟蛋白的三维结构预测分析  56-57
  4 讨论  57-58
    4.1 关于枯草芽孢杆菌细胞总DNA提取  57
    4.2 内切葡聚糖酶基因的PCR扩增  57-58
    4.3 关于菌落PCR  58
    4.4 关于内切葡聚糖酶基因的结构  58
  结论  58-59
参考文献  59-64
致谢  64-65
攻读硕士期间发表的论文  65

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内容摘要

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