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转attM基因彩色马蹄莲及AttM解酯酶抗体制备研究

作　者: 杨雪
导　师: 邵敏
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 彩色马蹄莲 attM基因土壤根癌农杆菌蛋白免疫
分类号: S682.264
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

彩色马蹄莲是天南星科(Araceae)中的一种单子叶观赏植物,被公认为21世纪“花卉之星”,市场前景广阔。但由胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovora subsp. carotovora, p. c. c)引起的细菌性软腐病(bacterial soft rot disease)造成田间和贮藏期彩色马蹄莲大量腐烂死亡,且目前没有理想的防治对策,严重阻碍了彩色马蹄莲的产业化发展。近年来的研究发现,细菌不同细胞间存在化学信号交流,当群体信号分子达到一定密度时,菌体内相关基因即启动表达,该现象被称为群体感应(quorum sensing,简称QS)。在一些原核生物和真核生物中,人们已经鉴定出一些群体感应淬灭酶(quorum-quenching enzyme),这些群体感应淬灭酶能够降解病原菌产生的信号分子使病原菌QS系统不能启动它所调控的基因,从而干扰QS系统,减轻和消除病原菌的致病性,防治病害的发生。胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种是一种革兰氏阴性细菌,其产生的常见信号分子是N-酰基-高丝氨酸内酯类(N-Acyl-homoserine lactone,简称AHL)物质。迄今为止,已经报道并研究的含群体感应淬灭酶活性的菌种不下10种,不同来源的类AHL解酯酶(AHLase)在氨基酸序列上也有所不同。系统发育分析显示,原核生物中的AHL可以划归为两个簇,即AiiA簇和AttM簇。本研究根据已报道的attM基因序列设计引物,从土壤根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105中PCR扩增获得attM基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点,将其克隆入植物表达载体pBI121,构建成重组质粒pBI121-attM。重组质粒通过冻融法转化至大肠杆菌DH5α中,经PCR,酶切和测序验证正确后,转化土壤根癌农杆菌EHA105。挑选阳性克隆菌落,对其进行菌落PCR、酶切和测序验证正确后,供转化使用。由土壤根癌农杆菌EHA105介导,将含有nptⅡ基因的重组表达质粒pBI121-attM转化彩色马蹄莲的芽基盘切片,经G-418筛选,最终从近万块芽基盘切片中获得了4株阳性再生转基因植株。经gus染色和PCR检测证明attM基因已整合到彩色马蹄莲基因组中。为进一步研究和利用attM基因,为防控细菌性软腐病奠定基础,本研究根据已报道的attM基因序列设计引物,从土壤根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中PCR扩增获得attM基因,构建蛋白表达载体pET30a-attM,在大肠杆菌BL21中诱导AHLase蛋白的表达。SDS-PAGE检测发现attM基因能高效表达AttM解酯酶蛋白。利用SDS-PAGE中对应的AttM解酯酶蛋白直接进行成兔免疫,获取其抗体血清,ELISA和Western Blot检测了证明此免疫方法的可行性。

全文目录

摘要 7-9ABSTRACT 9-11上篇文献综述 11-43 第一章彩色马蹄莲 12-20 1 彩色马蹄莲的植物学特征和生态学习性 12-13 2 彩色马蹄莲的繁殖 13-14 3 彩色马蹄莲的主要病害及其防治措施 14-20 3.1 彩色马蹄莲主要病害 14-15 3.1.1 病毒病 14 3.1.2 真菌病 14-15 3.1.3 细菌性软腐病 15 3.2 彩色马蹄莲主要病害防治措施 15-20 3.2.1 选种无病材料 15-16 3.2.2 栽培管理 16 3.2.3 化学防治 16-17 3.2.4 选育抗性品系 17-20 第二章细菌群体感应系统及其应用 20-30 1 群体感应系统 20-23 2 群体感应淬灭研究 23-28 2.1 群体感应淬灭酶的存在 25-26 2.2 群体感应淬灭酶的作用机制和特性 26-27 2.3 AHL解酯酶的生物学功能 27-28 3 信号分子类似物干扰病原菌QS系统 28-30 第三章转基因花卉的研究进展 30-43 1 花卉转基因方法简介 31-33 1.1 农杆菌介导法 31-32 1.2 基因枪法 32-33 1.3 其它 33 2 转基因技术在花卉新品种、新体系中的应用 33-39 2.1 改变花季 33-34 2.2 改变花形 34-35 2.3 改变花色 35-36 2.4 改变花香 36-37 2.5 抗性改良 37-38 2.5.1 抗病虫害研究 37 2.5.2 抗逆性改良 37-38 2.6 延长瓶插寿命 38-39 3 我国转基因花卉的现状、问题和展望 39-43 3.1 建立中国重要花卉种质基因库 39-40 3.2 加快花卉育种及产业化发展 40 3.3 加强转基因花卉研究的交流合作 40-43下篇研究内容 43-82 第一章植物表达载体的构建 44-58 1 材料 45-47 1.1 供试菌株及来源 45-47 1.2 培养基、抗生素、生长素与培养条件 47 1.3 试剂和酶 47 2 方法 47-54 2.1 目的基因的克隆验证 47-51 2.2 pBI121-attM载体的构建 51-54 3 结果和分析 54-56 3.1 attM基因的克隆验证 54 3.2 pBI121-attM载体的构建 54-55 3.3 转化农杆菌的重组载体验证 55-56 4 讨论 56-58 第二章转基因彩色马蹄莲的产生和鉴定 58-70 1 实验材料 59-60 1.1 微生物材料 59 1.2 转化受体植物材料 59 1.3 抗生素和生长素 59 1.4 培养基 59-60 2 实验方法 60-64 2.1 彩色马蹄莲组培苗的获得与扩繁 60 2.2 彩色马蹄莲抗性浓度选择压的确定 60 2.3 转基因彩色马蹄莲的产生 60-61 2.4 gus染色 61 2.5 转基因彩色马蹄莲的PCR检测 61-64 3 结果和分析 64-66 3.1 彩色马蹄莲组培苗的获得与扩繁 64 3.2 彩色马蹄莲抗性浓度选择压的确定 64 3.3 转基因彩色马蹄莲的获得 64-65 3.4 gus染色检测 65-66 3.5 转基因彩色马蹄莲的PCR检测 66 4 讨论 66-70 第三章 N-酰基高丝氨酸内酯解酯酶的抗体制备及应用 70-82 1 实验材料 71-72 1.1 供试凶株及来源 71-72 1.2 试验动物 72 1.3 主要试剂 72 2 实验方法 72-77 2.1 蛋白表达载体pET30a-αttM的构建 72-74 2.2 AttM解酯酶的表达、免疫与鉴定 74-77 3 结果与分析 77-80 3.1 蛋白表达载体pET30a-attM的构建 77 3.2 AttM解酯酶蛋白的表达、免疫与鉴定 77-80 4 讨论 80-82缩略语 82-84附录一 attM基因序列 84-85附录二本文用到的培养基和辅助试剂配方 85-88附录三 SDS-PAGE所用试剂配方 88-90附录四 ELISA辅助试剂及配法 90-92参考文献 92-100攻读硕士期间发表或待发表论文情况 100-102致谢 102

转attM基因彩色马蹄莲及AttM解酯酶抗体制备研究

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