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甘蓝型油菜线粒体DNA提取及基因表达分析研究

作　者: 郑秀
导　师: 管荣展
学　校: 南京农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 甘蓝型油菜线粒体DNA 提取纯化基因表达
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究表明植物细胞质雄性不育(Cytoplasmic Male Sterility, CMS)主要与线粒体基因(Mitochondrial DNA, mtDNA)有关。本研究摸索建立了高纯度线粒体DNA 提取纯化的技术体系,分析16个线粒体基因及1个线粒体基因片段orfl41在甘蓝型油菜细胞质雄性不育系H526A及其可育杂交组合的表达量,为阐明油菜线粒体雄性不育的分子机制提供了基础。主要研究结果如下：(1)甘蓝型油菜高纯度线粒体DNA提取技术体系的建立：通过比较不同处理对mtDNA得率及质量的影响,优化实验方法,建立了一套高效率高质量的线粒体DNA提取体系。取生长7d的甘蓝型油菜幼苗用匀浆器彻底磨碎,匀浆液采用1层纱布粗滤,4层100目的尼龙网过滤,收集滤液。3,000g离心15min,分离破碎组织,17,000g离心15min分离线粒体,收集沉淀。悬浮沉淀,3.000g离心10min,取上清。加入DNaseⅠ室温酶切30min,后转入4℃酶切1h,加入EDTA终止酶切反应。18,000g离心20min富集线粒体,沉淀即为粗制线粒体。选择蔗糖浓度为1.45M和1.2M的溶液,按照1:1(v/v)的比例铺制不连续密度梯度,并将粗制线粒体悬浮在此密度梯度上,72.000g超速离心90mmin,收集蔗糖分界处的样品环带。将收集的样品经20,000g离心20min,沉淀即为高纯度的线粒体。SDS-蛋白酶K裂解后,分离纯化mtDNA。通过建库测序、紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳、酶切验证等手段对提取的mtDNA进行浓度和纯度分析,表明采用本实验体系提取的mtDNA质量好、纯度高,足以满足后续的酶切、PCR、基因克隆、基因组测序等后续分子生物学研究。(2)甘蓝型油菜细胞质雄性不育系的线粒体基因表达分析：采用由原生质体融合杂种不育株培育而得到的细胞质雄性不育系H526A和其对应的可育杂交组合Fl,提取其花和蕾的RNA,反转录成cDNA。实时定量RT-PCR分析表明：orf222基因及其基因片段orf141在不育系H526A蕾中的表达量明显高于可育杂交组合的,cox2-1基因在不育系蕾中的表达量略高于可育杂交组合的,其它基因的表达量均低于其在可育杂交组合的。推测orf222可能是细胞质雄性不育的相关基因的候选基因,而cox2-1基因也起到很重要的作用。还发现5个基因及基因片断orf141表达量在花和蕾中存在明显差异,5个基因分别是orf222、cox2-1、cob、rps7和atp1基因,其它基因在这两个器官中的表达量差异不明显。

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摘要 5-6ABSTRACT 6-8第一章文献综述 8-22 1.1 植物线粒体基因组与雄性不育 8-15 1.2 油菜线粒体基因组 15-16 1.3 植物线粒体基因表达分析 16-18 1.4 植物线粒体DNA的提取 18-20 1.5 本研究的目的意义 20-22第二章甘蓝型油菜线粒体DNA提取 22-36 2.1 材料和方法 22-27 2.2 结果和分析 27-32 2.3 讨论 32-36第三章甘蓝型油菜线粒体基因表达分析 36-46 3.1 材料和方法 36-39 3.2 结果和分析 39-44 3.3 讨论 44-46第四章全文结论和讨论 46-50 4.1 全文结论 46 4.2 全文讨论 46-48 4.3 创新点 48-50参考文献 50-58附录 58-60在读硕士学位期间发表的论文 60-62致谢 62

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