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噬菌体展示技术筛选幽门螺旋杆菌单链抗体的研究
作 者: 纪卿
导 师: 张灏
学 校: 江南大学
专 业: 微生物学
关键词: 幽门螺旋杆菌 噬菌体展示技术 scFv 细胞筛选 ELISA
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2008年
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内容摘要
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H. pylori)于1983年由澳大利亚学者Warren和Marshall从慢性胃炎患者胃粘膜中成功分离出。H. pylori是一种革兰氏阴性螺旋状杆菌,在胃上皮细胞定居繁殖。大量研究证实,H. pylori是慢性胃炎、消化性溃疡及胃肠道淋巴瘤的主要致病因素,并与胃癌发生密切相关。1994年国际癌症研究中心(IARC)将H. pylori列为I类致癌因子。由于目前治疗消化性溃疡三联治疗法存在着很多不足,因此能获得针对H. pylori的特异性抗体成为现在众多学者研究的热点。本文主要采用噬菌体展示技术首次从人源单链抗体文库Tomlinson I + J中用细胞筛选法筛选抗H. pylori的抗体。直接用H. pylori细胞固定进行五轮筛选,通过ELISA检测,第四轮筛选得到的含有单链抗体噬菌体在显色值达到最高,为阴性对照的4倍;随后,从随机挑选的96个克隆中获得了1株阳性克隆。再分别将阳性克隆与10种常见菌进行ELISA的交叉反应,最终得到1株含H. pylori的人源性单链抗体的噬菌体JH1。随后又进一步对JH1所表达的scFv基因进行PCR扩增,分别得到scFv的VH片段、VL片段和全长基因分别为527 bp、368 bp和935 bp,这些包含着部分载体序列的DNA片段与理论值相符。通过对人源性单链抗体全基因进行测序,在NCBI中进行基因序列比对,与已报道的一种植物RNA病毒的复制酶单链抗体基因序列有96%同源性。将阳性克隆JH1转入E.coli HB2151中进行分泌表达,并对表达产物进行ELISA检测,JH1在A540/A630的吸光值的比值远远高于作为空白对照的PBS或混合菌。这些证明scFv蛋白能够与H. pylori细胞特异性结合。之后,对表达后的大肠杆菌细胞通过反复冻融的方法进行破碎,我们采用亲和层析的方法对细胞破碎液进行纯化,通过SDS-PAGE电泳分析,在电泳图上获得一条纯化后的单一条带。
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全文目录
摘要 3-4 Abstract 4-8 第一章 绪论 8-20 1.1 幽门螺旋杆菌的发现及意义 8 1.1.1 幽门螺旋杆菌的发现 8 1.1.2 幽门螺旋杆菌发现的意义 8 1.2 幽门螺旋杆菌的特性 8-9 1.2.1 幽门螺旋杆菌的形态学特征 8-9 1.2.2 幽门螺旋杆菌的生理学和分子生物学特征 9 1.3 幽门螺旋杆菌的致病机制 9-11 1.3.1 H. pylori 的毒力因子 9-10 1.3.2 H. pylori 的黏附与定植 10 1.3.3 H. pylori 菌株 10 1.3.4 H. pylori 感染与炎症损伤 10-11 1.4 幽门螺旋杆菌的诊断方法 11-12 1.4.1 侵入性方法 11-12 1.4.2 非侵入性方法 12 1.5 幽门螺旋杆菌相关疾病的治疗 12-13 1.5.1 抗菌治疗 12-13 1.5.2 抗氧化剂治疗 13 1.6 噬菌体展示技术 13-15 1.6.1 噬菌体表面展示技术的原理与方法 13-14 1.6.2 噬菌体抗体库淘洗富集的原理与方法 14-15 1.6.3 噬菌体展示技术在幽门螺旋杆菌研究中的应用 15 1.6.4 噬菌体展示技术的意义 15 1.7 基因工程抗体 15-18 1.7.1 小分子抗体scFv,Fab,F(ab’)~2、Fv 15-16 1.7.2 小分子抗体特点及意义 16 1.7.3 单链抗体的构建 16 1.7.4 单链抗体的表达载体 16-17 1.7.5 单链抗体的可溶性表达 17 1.7.6 基因工程抗体的应用展望 17-18 1.8 立题背景 18 1.9 研究内容 18-20 第二章 幽门螺旋杆菌单链抗体的筛选 20-29 2.1 引言 20 2.2 材料 20-22 2.2.1 菌株与文库 20-21 2.2.2 实验主要试剂 21 2.2.3 实验仪器 21-22 2.2.4 培养基、溶液的配制及灭菌方法 22 2.3 实验方法 22-26 2.3.1 幽门螺旋杆菌的培养 22-23 2.3.2 Tomlinson 文库的扩增以及滴度的测定 23 2.3.3 Tomlinson 文库的保存 23 2.3.4 KM13 辅助噬菌体的制备 23-24 2.3.5 空白细胞菌株的培养 24 2.3.6 噬菌体侵染E.coli TG1 最适侵染条件的摸索 24-25 2.3.7 幽门螺旋杆菌scFv 的筛选 25 2.3.8 单克隆scFv 的挑选 25-26 2.4 实验结果与分析 26-28 2.4.1 幽门螺旋杆菌的培养 26 2.4.2 Tomlinson 文库和KM13 辅助噬菌体滴度的测定 26-27 2.4.3 噬菌体侵染E.coli TG1 最适侵染条件 27-28 2.4.4 幽门螺旋杆菌scFv 的筛选 28 2.5 本章小结 28-29 第三章 幽门螺旋杆菌单链抗体的鉴定 29-40 3.1 引言 29 3.2 材料 29-30 3.2.1 菌株与文库 29 3.2.2 实验主要试剂 29 3.2.3 实验仪器 29-30 3.2.4 培养基、溶液的配制及灭菌 30 3.3 实验方法 30-33 3.3.1 幽门螺旋杆菌固定条件的摸索 30-31 3.3.2 Tomlinson 文库每轮筛选结果的ELISA 检测 31 3.3.3 单克隆scFv 的ELISA 检测 31-32 3.3.4 测定阳性克隆交叉反应 32 3.3.5 阳性克隆的scFv 基因的PCR 鉴定 32-33 3.3.6 阳性克隆PIT2 质粒的酶切分析 33 3.3.7 阳性克隆scFv 基因测序 33 3.4 实验结果与分析 33-38 3.4.1 幽门螺旋杆菌细胞的最适固定条件 33-34 3.4.2 Tomlinson 文库每轮筛选结果的ELISA 检测 34-35 3.4.3 单克隆scFv 的ELISA 鉴定结果 35 3.4.4 测定阳性克隆交叉反应 35-36 3.4.5 阳性克隆的scFv 基因的PCR 鉴定 36 3.4.6 阳性克隆PIT2 质粒的酶切分析 36-38 3.4.7 阳性克隆scFv 基因测序 38 3.5 本章小结 38-40 第四章 幽门螺旋杆菌单链抗体的表达与纯化 40-46 4.1 前言 40 4.2 材料 40-41 4.2.1 菌株与文库 40 4.2.2 实验主要试剂 40 4.2.3 实验仪器 40-41 4.2.4 培养基、溶液的配制及灭菌 41 4.3 实验方法 41-43 4.3.1 阳性克隆JH1 可溶性scFv 的表达 41-42 4.3.2 scFv 的ELISA 检测 42 4.3.3 scFv 的Ni 柱纯化 42-43 4.3.4 scFv 的 SDS-PAGE 凝胶电泳 43 4.4 实验结果与分析 43-45 4.4.1 scFv 的ELISA 检测 43-44 4.4.2 scFv 的Ni 离子柱纯化及SDS-PAGE 分析 44-45 4.5 本章小结 45-46 主要结论 46-47 致谢 47-48 参考文献 48-54 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 54
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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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