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兔HGPRT基因打靶载体的构建及转基因成纤维细胞中GFP基因表达的研究

作　者: 王伟
导　师: 姚刚；陈学进
学　校: 新疆农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: HGPRT 基因敲除成体兔成纤维细胞细胞筛选
分类号: S829.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 44次
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内容摘要

与小鼠相比,兔在生理、解剖、进化等方面和人类更接近；相对于其它实验动物,兔饲养成本较少,是研究心血管系统、肺部疾病和代谢疾病的合适动物模型。因此通过基因改造获得人类疾病模型兔在医学研究方面有着良好的应用前景和市场价值。基因敲除是建立在同源重组技术基础之上的一种定点修饰基因组的实验方法,其与体细胞核移植技术的成功结合,已经为生物体内基因功能的研究和人类相关疾病的动物模型的建立提供了新的思路和方法。本论文主要致力于HGPRT基因缺陷医学模型兔的建立,从而为HGPRT基因缺陷引起相关疾病的机理和治疗的研究提供条件。整个实验分成两部分,第一部分,在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, HGPRT)基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12.5kb无启动子的HGPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-HGPRT质粒。然后基于pKS-HGPRT和pEGFP-C1-SD1211质粒,构建了含有绿色荧光蛋白(GFP)及新霉素(neo)筛选标记基因的打靶载体pKS-HGPRT-GFP-neo。将线性化的打靶载体通过脂质体转染的方法整合到成体兔成纤维细胞基因组中,利用G418及6-TG进行细胞克隆的抗药物筛选,共得到抗性细胞克隆20个。对细胞克隆进行PCR及测序初步鉴定,获得8个发生同源重组的细胞克隆,还需利用Southern blotting做进一步验证。第二部分,在Oμg/mL G418、200μg/mLG418、400μg/mL G418和600μg/mLG418的条件下对转基因成纤维细胞进行维持培养,然后再通过细胞周期的分析、染色体计数的分析以及流式细胞仪的分析,对外源基因在成纤维细胞中表达情况就行了研究。本研究成功构建了含有GFP基因的HGPRT表达质粒,并发现了转基因成纤维细胞在传代培养的过程中出现了GFP基因表达减弱的现象。基于以上实验,为研究HGPRT在相关疾病中的作用,探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HGPRT基因缺陷动物疾病模型奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章引言  8-19
  1.1 基因打靶的研究进展  8-12
  1.2 转基因沉默的研究进展  12-16
  1.3 本论文的研究内容  16-19
第二章兔HGPRT基因打靶载体的构建  19-36
  2.1 实验材料  19-22
  2.2 实验方法  22-29
  2.3 实验结果  29-33
  2.4 讨论  33-36
第三章转基因成纤维细胞中GFP基因表达减弱的研究  36-50
  3.1 实验材料  36
  3.2 实验方法  36-38
  3.3 实验结果  38-47
  3.4 讨论  47-50
第四章结论  50-51
参考文献  51-60
附录  60-63
致谢  63-64
作者简历  64

兔HGPRT基因打靶载体的构建及转基因成纤维细胞中GFP基因表达的研究

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