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华东地区鸭圆环病毒感染流行病学调查及其单克隆抗体的制备

作 者: 苏小东
导 师: 陈溥言
学 校: 南京农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 鸭圆环病毒 重组全长Cap蛋白 间接ELIsA 禽流感 免疫抑制 单克隆抗体
分类号: S858.32
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


圆环病毒是多种动物都感染的重要病原,主要侵害免疫系统,给养殖业带来很大损失,引起了世界广泛关注。鸭圆环病毒(DuCV)于2003年由德国学者Hattermann首次报,是迄今发现感染鸭的最小病毒,属圆环病毒科圆环病毒属成员,无囊膜,球形或20面体对称,直径在15nm左右,基因组为环状单股DNA,有两个主要的阅读框,ORFV1编码Rep蛋白,ORFC1编码Cap蛋白。由于目前对其研究较少,其致病特点与机理目前还不清楚。但国内外先后对其流行情况进行了多次报道,由此可见,鸭群的鸭圆环病毒感染流行已经相当普遍,应该引起足够的重视。Cap蛋白是圆环病毒产生保护性抗体的主要抗原区域,具有广泛的应用价值,为了表达鸭圆环病毒的全长Cap蛋白,本研究以从华东地区采集的鸭法氏囊样品中提取病毒基因组作为模板,设计引物,通过PCR方法扩增DuCV全长cap基因序列(774 bp),并与pET32a(+)载体相连,原核表达了DuCV重组Cap蛋白。而之前文献报道圆环病毒全长Cap蛋白不能原核表达,Shao-Ning Liu将N端前36个氨基酸去掉表达了截短的DuCV-Cap蛋白,而本研究成功的表达了全长Cap蛋白,抗原区域比截短的Cap蛋白更长,因此抗原性可能也会更好。目前尚无诊断鸭圆环病毒抗体的商品化ELISA试剂盒,为了对华东地区DuCV血清流行病学情况进行调查,本试验以纯化后的重组Cap蛋白作为抗原,通过优化各步反应条件,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法。最终确定最佳抗原包被浓度为12.5μg/ml,鸭血清最佳稀释倍数为1:80;判断标准为样品OD值≥0.40判定为阳性,OD值<0.40判定为阴性,通过试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。用此方法对从华东地区收集的19个鸭群(日龄不同,共四个品种)的321份血清样品进行检测,结果为DuCV抗体总阳性率为45.8%,其中江苏地区为26.7%,山东地区为60.9%,对所得数据进行分析发现随着日龄的增加,DuCV抗体阳性率也随之增加;不同品种DuCV感染情况也不同,说明DuCV感染可能与鸭的品种有关。鸭是禽流感病毒的主要宿主,也是其重要传播媒介,因此禽流感疫苗免疫对鸭群至关重要,而临床上经常出现鸭群接种禽流感疫苗后抗体产生不稳定的现象,为了揭示这一现象产生的可能原因,对上述同一批血清样品进行禽流感(H5和H9)抗体滴度测定,然后对禽流感疫苗免疫后抗体滴度不合格样品与DuCV感染的关系进行统计(禽流感不合格样品在DuCV阳性样品中所占比例vs.禽流感不合格样品在DuCV阴性样品所占的比例)得:禽流感H5亚型抗体检测结果为山东地区(16.7%vs.9.8%),江苏地区(57%vs.36.3%);禽流感H9亚型抗体检测结果为山东地区(47.2%vs.19.7%),江苏地区(75%vs.69%)。由此可知禽流感抗体不合格样品在DuCV阳性样品中所占比例均高于其在DuCV阴性样品中所占的比例,而且差异极显著。这表明DuCV的感染抑制了免疫后正常抗体的产生,从而为阐明鸭圆环病毒感染造成的危害提供了依据。为了对DuCV进一步的研究,还进行了其单克隆抗体的制备,以纯化的原核表达重组Cap蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,融合率为1000%,经间接ELISA方法筛选获得了3株能稳定分泌抗DuCV-Cap蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,并分别命名为1G5B11,2E6C1和3E9C7,间接ELISA检测其细胞上清效价分别为1:1024,1:512,1:1024;腹水效价均大于105。经单抗亚类试剂盒测定三株单抗均为IgG1亚型。用分段表达的Cap蛋白做Western Blot分析表明,三株单抗对羧基端缺失的Cap蛋白能够识别,而对C1(154-258 aa)和C2(53-209 aa)两段均不识别,说明其针对的表位位于Cap蛋白氨基端前52个左右的氨基酸上,在此之前尚未有过DuCV-Cap蛋白表位的相关报道,本研究为DuCV基因工程疫苗等的研制提供了依据。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-11英文缩写词表  11-12第一章 鸭圆环病毒研究进展  12-20  1.1 鸭圆环病毒发现  12  1.2 鸭圆环病毒的病毒学分类地位  12  1.3 鸭圆环病毒的形态学特征  12-13  1.4 鸭圆环病毒的分子生物学特征  13-15  1.5 鸭圆环病毒感染的诊断方法  15-16  1.6 感染鸭圆环病毒的临床症状及组织病理变化  16  1.7 鸭圆环病毒感染的流行情况  16-18  参考文献  18-20第二章 鸭圆环病毒重组Cap蛋白的原核表达  20-36  摘要  20-21  2.1 试验材料  21  2.2 试验方法  21-27  2.3 试验结果  27-32  2.4 讨论  32-33  Abstract  33-34  参考文献  34-36第三章 检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法的建立  36-44  摘要  36  3.1 试验材料  36-37  3.2 试验方法  37-38  3.3 试验结果  38-40  3.4 讨论  40-42  Abstract  42-43  参考文献  43-44第四章 鸭圆环病毒感染对鸭禽流感疫苗免疫效果的影响  44-54  摘要  44-45  4.1 试验材料  45  4.2 试验方法  45-47  4.3 试验结果  47-50  4.4 讨论  50-52  Abstract  52-53  参考文献  53-54第五章 鸭圆环病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定  54-64  摘要  54-55  5.1 试验材料  55  5.2 试验方法  55-58  5.3 试验结果  58-60  5.4 讨论  60-62  Abstract  62-63  参考文献  63-64全文总结  64-66附录  66-70致谢  70

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