学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

抗噻菌灵单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

作　者: 王玉燕
导　师: 刘凤权
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 噻菌灵 单克隆抗体 ELISA HPLC
分类号: S482.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 16次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


噻菌灵属高效、低毒和广谱的内吸性杀菌剂,广泛应用于庄稼生产、储存过程中。它较易在土壤、水以及作物中残留,对人、畜等非靶标生物造成伤害。国内国外对蔬果中噻菌灵的残留量都十分重视。噻菌灵的常规检测方法主要是液相色谱法,但是这种检测方法存在繁琐、费时、价格昂贵等缺点。而ELISA具备简便、快速、灵敏、便宜等优点,目前国内还没有针对噻菌灵单克隆抗体及酶免疫检测方法的报道。因此,本研究的目的就是为噻菌灵残留检测提供了一种快速、灵敏检测方法。具体研究内容如下：人工抗原制备：本研究根据噻菌灵的结构特点,在其三个不同位点分别连接手臂制备了三种不同的半抗原,2-(2’-丁二酰胺基-4’-噻唑)苯并咪唑(H1),5-琥珀酰胺基-2-(4’-噻唑)苯并咪唑(H2),4-苯并咪唑基-2(4’-噻唑)正丁酸(H3),核磁鉴定结果表明三种半抗原成功合成。通过活泼醋法(NHS), H1、H2和H3分别与牛血清蛋白(BSA)偶联作为免疫原,与卵清蛋白(OVA)偶联作为包被原。通过全波长紫外扫描表明偶联成功。单克隆抗体制备：将H1-BSA、H2-BSA、H3-BSA分别免疫Balb/c小鼠,经多次免疫后小鼠尾部静脉采血测效价,各选择效价最高的小鼠进行融合。采用常规杂交瘤技术,用PEG法将其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化,建立可稳定分泌抗噻菌灵的杂交瘤细胞株。结果H1筛选到1-4G9、1-6D3两株和H3筛选到3-1F9、3-5D4两株共4株能够稳定分泌抗噻菌灵单克隆抗体的细胞株。采用间接竞争酶联免疫法(IC-ELISA),将上述四株抗体分别与三种包被抗原组合,在12种组合中选择了一种最优异源组合：H3-OVA/1-6D3。1-6D3细胞株通过腹腔注射普通小白鼠采集腹水大量制备抗体。对1-6D3抗体进行效价、特异性测定。实验测定结果为：此株抗体稀释1600倍；与其他结构类似物交叉反应率小于0.1%。噻菌灵ELISA检测方法的建立：将H3-OVA/1-6D3异源组合运用于噻菌灵ELISA检测方法的建立,进行了工作浓度、理化因素影响、灵敏度和准确性试验。实验结果为：最佳工作浓度为H3-OVA 5 ug.mL-1,1-6D3稀释1600倍；理化因素中四种封闭物对ELISA无明显影响、最佳离子浓度为0.8mol.L-1、pH值为7.5、有机溶剂中甲醇含量在5%以内影响较小。据此建立的ELISA检测方法,以Logit(B/Bo)作纵坐标与农药浓度的对数值作横坐标建立标准曲线,检测方程为y=3.133X+3.259, R2为0.984。噻菌灵的IC10和IC5o分别为5.4μg.L-1,10.9μg.L-1。在自来水、苹果和梨的添加回收试验中,ELISA测得结果依次为95.9%-118.1%、90%-117.6%、74.9%-95.6%;HPLC测得结果依次为84.4%-109.7%、85.4%-115.8%、81.3%-121.7%。ELISA方法的测定结果与HPLC的测定结果进行相关性分析,相关系数R2达到0.96以上。实验结果表明：成功合成了三种噻菌灵半抗原；制备了抗噻菌灵的特异性强单克隆抗体；建立了噻菌灵ELISA的检测方法,并成功运用于自来水、苹果、梨的添加回收。这不仅达到了实验的目的—为噻菌灵残留检测提供了一种快速、灵敏检测方法,也为农药残留检测试剂盒的开发提供了基础,为环境安全检测提供了重要的工具。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11文献综述  11-40  第一章 农药残留速测研究的重要性  12-26    1 农药残留的现状及危害  12-17      1.1 农药残留的现状  12-13      1.2 农药残留问题的主要危害  13-15      1.3 农药残留的主要方面  15-17      1.4 开展农药残留速测技术研究的意义  17      1.5 我国农药残留控制措施的研究进展  17    2 农药残留分析技术的发展动态  17-23      2.1 仪器分析方法  18-20      2.2 生物学分析方法  20-22      2.3 免疫分析方法  22-23    3 苯并咪唑类农药残留检测研究  23-24      3.1 苯并咪唑类农药残留现状  23      3.2 苯并咪唑类农药残留分析  23-24    4 农药残留检测技术发展方向  24-26      4.1 完善快速检测技术  24      4.2 突破在线检测技术  24-25      4.3 提高测定复杂样品的能力  25-26  第二章 酶免疫检测技术在农药残留分析中的应用  26-40    1 农药残留免疫分析技术  31-33      1.1 农药残留酶免疫分析技术特点  31-32      1.2 酶联免疫吸附测定法(ELISA)原理及分类  32-33    2 农药小分子的残留免疫分析  33-35      2.1 半抗原的制备  33-34      2.2 人工抗原的合成与优选  34-35      2.3 人工抗原的纯化、鉴定  35    3 农药等小分子抗体制备技术研究进展  35-40      3.1 多克隆抗体的制备  36      3.2 单克隆抗体的制备  36-37      3.3 基因重组抗体的制备  37-40研究内容  40-82  第一章 噻菌灵农药三种半抗原的合成与鉴定  42-54    1 实验部分  43-49      1.1 试剂与仪器  43-44      1.2 试验方法  44-49    2 结果与分析  49-52      2.1 半抗原结构鉴定  49-50      2.2 人工抗原偶联鉴定  50-52    3 讨论  52-54      3.1 关于半抗原的设计  52      3.2 关于抗原的合成与鉴定  52-54  第二章 噻菌灵单克隆抗体制备  54-70    1 材料与方法  54-65      1.1 材料与仪器  54-56      1.2 实验方法  56-65    2 结果与分析  65-67      2.1 小鼠血清效价测定  65-66      2.2 单克隆抗体的大量制备  66      2.3 单克隆抗体的特异性分析  66-67    3 讨论  67-70      3.1 单克隆抗体制备过程中的几个重要环节  67      3.2 关于单克隆抗体的大量制备  67-70  第三章 噻菌灵间接竞争ELISA方法的建立  70-82    1 实验材料与方法  71-74      1.1 材料与仪器  71      1.2 噻菌灵间接竞争ELISA最佳工作条件的确定  71-74    2 结果与分析  74-79      2.1 抗原抗体组合筛选  74      2.2 最佳工作浓度  74-75      2.3 理化因素对ELISA的影响  75-76      2.4 ELISA标准曲线的建立  76-77      2.5 准确度测定及HPLC方法验证  77-79    3 讨论  79-82      3.1 关于ELISA检测灵敏度分析  79-80      3.2 关于间接竞争ELISA最佳工作条件的确定  80      3.3 ELISA与HPLC检测方法比较分析  80-82参考文献  82-88附录一  88-91附录二  91-92附录三  92-94致谢  94

相似论文

  1. 抗吡虫啉—甲基对硫磷双特异性单克隆抗体的研究,S482.2
  2. 微纤维相关蛋白4在肝纤维化组织中的表达和外周血浓度与肝病理分级的相关性研究,R575.2
  3. 企鹅珍珠贝Cd-MT酶联免疫检测方法的建立及试剂盒的初步研制,X835
  4. 消癌平制剂及其绿原酸单体的药动学研究与质量控制,R285
  5. 甲型流感病毒M2蛋白的表达、纯化及其免疫原性的研究,R392
  6. 食品接触材料中双酚A的快速测定方法研究,TS206.4
  7. 地黄内生菌的分离鉴定和产梓醇菌株的筛选及其发酵研究,TQ461
  8. STLV-1病毒间接ELISA方法建立及杂交瘤细胞株的筛选,R373
  9. 鸭源鸡杆菌抗体消长规律研究及抗脂多糖单抗杂交瘤细胞株的建立,S858.32
  10. 免疫磁珠纯化人呼吸道合胞病毒融合蛋白方法的建立,R373
  11. 稳定分泌抗羊种布鲁菌脂多糖单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立,R392
  12. IBDV模拟表位与vp2组合基因的分子构建及其在昆虫细胞中的表达与应用,S852.65
  13. 传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备,S852.65
  14. 犬细小病毒2型VP2基因在昆虫细胞中的表达及血清抗体间接ELISA检测方法的建立,S852.65
  15. 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定,S852.65
  16. 茶叶中有效生化成分高效液相色谱检测法的建立及其在凤凰乌龙茶检测中的应用,TS272.7
  17. 丙草胺和乙草胺的酶联免疫吸附分析方法研究,S482.4
  18. Bacillus subtilis SQR9的黄瓜促生和枯萎病生防效果及其作用机制研究,S436.421
  19. 氯噻啉酶联免疫吸附分析方法研究,S482.3
  20. 云南十种辣椒抗氧化及抑菌活性的研究,S641.3

中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 各种农药 > 杀菌剂
© 2012 www.xueweilunwen.com