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犬细小病毒2型VP2基因在昆虫细胞中的表达及血清抗体间接ELISA检测方法的建立
作 者: 王敏敏
导 师: 王芳;姜平
学 校: 南京农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 犬细小病毒 VP2基因 表达 昆虫细胞 间接ELISA
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)属细小病毒科细小病毒属,是引起犬出血性肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。CPV-2只感染犬,具有高度的接触性传染性,各种年龄的犬都能感染,断奶后的幼龄犬(尤其12周龄以下的)最易感此病,发病率和病死率分别为20%~100%和10%~50%,临床表现为剧烈的呕吐、腹泻和排出恶臭的粪便。快速准确的诊断是有效预防本病的前提条件。因此,建立一种准确、特异和灵敏的诊断方法,对于犬细小病犬的早诊断、早隔离、早治疗具有重要意义。病毒的VP2蛋白既是CPV的主要免疫保护性抗原,又是良好的诊断抗原,因此,该基因的克隆及表达,对于制备新型疫苗和特异性诊断抗原具有重要意义。本研究根据Genbank已发表的CPV-2 VP2基因的序列,利用primer 5.0软件设计并合成一对引物,通过PCR扩增出长约1755bp的基因片段,命名为VP2。将其克隆至pMD-19-T载体,构建了重组质粒pMD-19-T-VP2。对其中的VP2进行序列测定,并将测序结果同CPV-2的其他几个分离株:CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c的VP2基因进行了序列比较。核苷酸序列同源性分别为98.3%、98.3%、98.2%,推导的编码氨基酸同源性分别为96.8%、96.4%、96.8%。通过对重组质粒pMD-19-T-VP2和真核表达载体pFastBacTMTA进行酶切,将VP2基因定向克隆至杆状病毒转移载体PFastBacTMTA的EcoRI和Xho I之间的多克隆位点上,获得重组转移载体pFastBacTMTA-VP2。再将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经蓝白斑筛选获得重组穿梭载体rBacmid-VP2,经脂质体介导转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP2。IFA、SDS-PAGE、Western-blotting分析,表明CPV-2 VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了表达。利用表达的CPV-2 VP2重组融合蛋白作为抗原,建立了CPV-2血清抗体检测的间接ELISA方法。对ELISA的反应条件进行优化,确定理想包被液是PBS (pH7.4),封闭液为5%小牛血清/PBS,血清稀释液为0.05%小牛血清/PBS,洗涤液为0.5MNaCl/0.5%Tween-20/PBS, ELISA最佳反应时间为1.0h, TMB显色液在37℃作用15min。建立的间接ELISA血清抗体检测方法为进行CPV的诊断与血清学调查提供了一种技术手段。
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全文目录
摘要 7-8ABSTRACT 8-10缩略语表 10-12第一部分 文献综述 12-30 第一章 犬细小病毒2型(CPV-2)研究进展 12-25 1 病原学 12-16 1.1 CPV一般生物学特性 12-14 1.2 CPV分子生物学特性 14-15 1.3 犬细小病毒空衣壳蛋白结构图 15-16 2 流行病学 16 3 致病机理和临床症状 16-18 3.1 致病机理 16-17 3.2 临床症状 17-18 4 CPV诊断方法 18 5 CPV预防控制 18-24 5.1 天然免疫 19-20 5.2 主动免疫 20-22 5.3 被动免疫 22-23 5.4 免疫程序 23-24 6 课题研究目的与意义 24-25 参考文献 25-30第二部分 实验研究 30-74 第二章 犬细小病毒2型(CPV-2)VP2基因的克隆与序列分析 30-40 1 材料 31 1.1 质粒、菌株与细胞 31 1.2 主要试剂与工具酶 31 1.3 主要仪器与设备 31 2 方法 31-34 2.1 CPV-2 VP2基因组的提取 31 2.2 引物设计与基因合成 31 2.3 CPV-2 VP2基因的克隆 31-32 2.4 PCR产物的同收纯化与连接反应 32-33 2.5 大肠杆菌DH5α感受态细菌的制备和转化 33 2.6 重组质粒的提取 33-34 2.7 重组质粒的鉴定和序列分析 34 3 结果 34-36 3.1 CPV-2 VP2基因片段PCR扩增 34-35 3.2 重组质粒的酶切鉴定和测序 35-36 4 讨论 36-38 参考文献 38-40 第三章 CPV2型(CPV-2)VP2基因在昆虫细胞中的表达及鉴定 40-54 1 主要材料与试剂 40-41 1.1 细胞、质粒、菌种、病毒 40-41 1.2 工具酶、主要试剂及溶液 41 2 方法 41-47 2.1 分别双酶切质粒pMD19-T-VP2和pFastBac~(TM)HTA并回收目的片段VP2和pFastBac~(TM)MHTA载体 41 2.2 日的基因与pFastBac~(TM)HTA转移载体的连接 41-42 2.3 重组质粒pFastBac~(TM)HTA-VP2的酶切鉴定 42 2.4 重组穿梭载体Bacmid的构建 42-43 2.5 重组杆状病毒的制备和鉴定 43-45 2.6 表达产物的鉴定 45-47 3 结果 47-51 3.1 重组质粒pFastBac~(TM)HTA-VP2酶切鉴定 47-48 3.2 重组穿梭载体的PCR鉴定 48 3.3 RT-PCR鉴定重组病毒 48-49 3.4 表达产物的鉴定 49-51 4 讨论 51-52 参考文献 52-54 第四章 犬细小病毒2型(CPV-2)血清抗体间接ELISA检测方法的建立 54-74 1 材料与方法 54-57 1.1 材料 55 1.2 方法 55-57 2 结果 57-69 2.1 抗原包被浓度、最佳封闭液和血清稀释液的确定 57-59 2.2 最佳血清稀释度的确定 59-60 2.3 酶标二抗稀释度的确定 60 2.4 一抗反应时间优化 60-61 2.5 羊抗犬IgG-HRP最佳反应时间的确定 61-62 2.6 最佳显色时间的确定 62-63 2.7 最佳封闭时间的确定 63-64 2.8 最佳包被条件的选择 64-65 2.9 间接ELISA阴、阳性临界值的确定 65-66 2.10 间接ELISA重复性试验 66-67 2.11 间接ELISA保存期试验 67 2.12 犬血清临床样本的检测 67-68 2.13 以CPV-2 VP2为包被抗原检测犬细小2型IgG抗体间接ELISA方法总结 68-69 3 讨论 69-71 参考文献 71-74全文总结 74-76附录 76-78致谢 78
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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