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犬细小病毒2型VP2基因在昆虫细胞中的表达及血清抗体间接ELISA检测方法的建立

作 者: 王敏敏
导 师: 王芳;姜平
学 校: 南京农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 犬细小病毒 VP2基因 表达 昆虫细胞 间接ELISA
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)属细小病毒科细小病毒属,是引起犬出血性肠炎和幼犬心肌炎的主要病原。CPV-2只感染犬,具有高度的接触性传染性,各种年龄的犬都能感染,断奶后的幼龄犬(尤其12周龄以下的)最易感此病,发病率和病死率分别为20%~100%和10%~50%,临床表现为剧烈的呕吐、腹泻和排出恶臭的粪便。快速准确的诊断是有效预防本病的前提条件。因此,建立一种准确、特异和灵敏的诊断方法,对于犬细小病犬的早诊断、早隔离、早治疗具有重要意义。病毒的VP2蛋白既是CPV的主要免疫保护性抗原,又是良好的诊断抗原,因此,该基因的克隆及表达,对于制备新型疫苗和特异性诊断抗原具有重要意义。本研究根据Genbank已发表的CPV-2 VP2基因的序列,利用primer 5.0软件设计并合成一对引物,通过PCR扩增出长约1755bp的基因片段,命名为VP2。将其克隆至pMD-19-T载体,构建了重组质粒pMD-19-T-VP2。对其中的VP2进行序列测定,并将测序结果同CPV-2的其他几个分离株:CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c的VP2基因进行了序列比较。核苷酸序列同源性分别为98.3%、98.3%、98.2%,推导的编码氨基酸同源性分别为96.8%、96.4%、96.8%。通过对重组质粒pMD-19-T-VP2和真核表达载体pFastBacTMTA进行酶切,将VP2基因定向克隆至杆状病毒转移载体PFastBacTMTA的EcoRI和Xho I之间的多克隆位点上,获得重组转移载体pFastBacTMTA-VP2。再将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经蓝白斑筛选获得重组穿梭载体rBacmid-VP2,经脂质体介导转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP2。IFA、SDS-PAGE、Western-blotting分析,表明CPV-2 VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了表达。利用表达的CPV-2 VP2重组融合蛋白作为抗原,建立了CPV-2血清抗体检测的间接ELISA方法。对ELISA的反应条件进行优化,确定理想包被液是PBS (pH7.4),封闭液为5%小牛血清/PBS,血清稀释液为0.05%小牛血清/PBS,洗涤液为0.5MNaCl/0.5%Tween-20/PBS, ELISA最佳反应时间为1.0h, TMB显色液在37℃作用15min。建立的间接ELISA血清抗体检测方法为进行CPV的诊断与血清学调查提供了一种技术手段。

全文目录


摘要  7-8ABSTRACT  8-10缩略语表  10-12第一部分 文献综述  12-30  第一章 犬细小病毒2型(CPV-2)研究进展  12-25    1 病原学  12-16      1.1 CPV一般生物学特性  12-14      1.2 CPV分子生物学特性  14-15      1.3 犬细小病毒空衣壳蛋白结构图  15-16    2 流行病学  16    3 致病机理和临床症状  16-18      3.1 致病机理  16-17      3.2 临床症状  17-18    4 CPV诊断方法  18    5 CPV预防控制  18-24      5.1 天然免疫  19-20      5.2 主动免疫  20-22      5.3 被动免疫  22-23      5.4 免疫程序  23-24    6 课题研究目的与意义  24-25  参考文献  25-30第二部分 实验研究  30-74  第二章 犬细小病毒2型(CPV-2)VP2基因的克隆与序列分析  30-40    1 材料  31      1.1 质粒、菌株与细胞  31      1.2 主要试剂与工具酶  31      1.3 主要仪器与设备  31    2 方法  31-34      2.1 CPV-2 VP2基因组的提取  31      2.2 引物设计与基因合成  31      2.3 CPV-2 VP2基因的克隆  31-32      2.4 PCR产物的同收纯化与连接反应  32-33      2.5 大肠杆菌DH5α感受态细菌的制备和转化  33      2.6 重组质粒的提取  33-34      2.7 重组质粒的鉴定和序列分析  34    3 结果  34-36      3.1 CPV-2 VP2基因片段PCR扩增  34-35       3.2 重组质粒的酶切鉴定和测序  35-36    4 讨论  36-38    参考文献  38-40  第三章 CPV2型(CPV-2)VP2基因在昆虫细胞中的表达及鉴定  40-54    1 主要材料与试剂  40-41      1.1 细胞、质粒、菌种、病毒  40-41      1.2 工具酶、主要试剂及溶液  41    2 方法  41-47      2.1 分别双酶切质粒pMD19-T-VP2和pFastBac~(TM)HTA并回收目的片段VP2和pFastBac~(TM)MHTA载体  41      2.2 日的基因与pFastBac~(TM)HTA转移载体的连接  41-42      2.3 重组质粒pFastBac~(TM)HTA-VP2的酶切鉴定  42      2.4 重组穿梭载体Bacmid的构建  42-43      2.5 重组杆状病毒的制备和鉴定  43-45      2.6 表达产物的鉴定  45-47    3 结果  47-51      3.1 重组质粒pFastBac~(TM)HTA-VP2酶切鉴定  47-48      3.2 重组穿梭载体的PCR鉴定  48      3.3 RT-PCR鉴定重组病毒  48-49      3.4 表达产物的鉴定  49-51    4 讨论  51-52    参考文献  52-54  第四章 犬细小病毒2型(CPV-2)血清抗体间接ELISA检测方法的建立  54-74    1 材料与方法  54-57      1.1 材料  55      1.2 方法  55-57    2 结果  57-69      2.1 抗原包被浓度、最佳封闭液和血清稀释液的确定  57-59      2.2 最佳血清稀释度的确定  59-60      2.3 酶标二抗稀释度的确定  60      2.4 一抗反应时间优化  60-61      2.5 羊抗犬IgG-HRP最佳反应时间的确定  61-62      2.6 最佳显色时间的确定  62-63      2.7 最佳封闭时间的确定  63-64      2.8 最佳包被条件的选择  64-65      2.9 间接ELISA阴、阳性临界值的确定  65-66      2.10 间接ELISA重复性试验  66-67      2.11 间接ELISA保存期试验  67      2.12 犬血清临床样本的检测  67-68      2.13 以CPV-2 VP2为包被抗原检测犬细小2型IgG抗体间接ELISA方法总结  68-69    3 讨论  69-71    参考文献  71-74全文总结  74-76附录  76-78致谢  78

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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