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抗转铁蛋白受体四价抗体(TfR-TeAb)的构建、表达和鉴定

作 者: 刘颖
导 师: 雷萍;沈关心
学 校: 华中科技大学
专 业: 免疫学
关键词: 转铁蛋白受体(TfR) 单链抗体(scFv) 四价抗体(TeAb) p53四聚体寡聚化结构域
分类号: R730.3
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 12次
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内容摘要


目的为提高抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)的亲和力,在前期研究工作成功构建抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)原核表达载体的基础上,本实验构建和表达抗转铁蛋白受体四价抗体(TfR-TeAb),鉴定其生物学活性,为抗转铁蛋白受体抗体在肿瘤诊断和治疗研究中的进一步应用奠定基础。方法①以pET28a-TfRscFv-D4S×5为模板,设计两条引物引入酶切位点NcoⅠ和EcoRⅠ,通过PCR方法扩增出TfR-scFv的片段。将TfR-scFv片段克隆到质粒pET28a–HSA-p53载体上,获得重组质粒pET28(a)-TfR-TeAb,转化大肠杆菌BL21,挑选单克隆菌株,并扩增,提取质粒后酶切,测序鉴定;②将大肠杆菌阳性克隆在37℃用IPTG诱导表达后,进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,确定抗体最佳表达时间和表达部位;③Ni2+-NTA亲和层析柱纯化包涵体蛋白,对纯化产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定;④将纯化后的蛋白进行梯度透析复性,再用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)分析活性蛋白的空间构象;用流式细胞术(FCM)检测蛋白与高表达TfR的肝癌细胞系HepG2结合活性,并在荧光显微镜下观察。结果①测序结果显示TfR-scFv和HSA-p53基因序列及开放阅读框正确无误,表明TfR-TeAb原核表达载体构建成功;②表达载体转化大肠杆菌BL21后,37℃,经IPTG诱导4h表达量最高,细胞亚定位分析结果显示蛋白主要以包涵体形式表达;③大量诱导表达后,收集包涵体蛋白,经Ni2+-NTA层析柱纯化,Western-blot显示纯化蛋白分子量的大小为36kD,与理论值相符合;④纯化蛋白经梯度透析复性后,Native -PAGE结果显示抗体蛋白以四聚体形式存在,分子量大小与TfR单克隆抗体和人IgG相近,约为144kD。FCM分析和免疫荧光显微镜观察,结果显示TfR-TeAb能与TfR表达阳性的HepG2细胞特异性结合且结合率与TfR-scFv相比有明显提高。结论①成功构建了TfR-TeAb原核表达载体;②目的蛋白在大肠杆菌BL21中以包涵体的形式表达;③复性后的TfR-TeAb能与TfR阳性细胞特异性结合,且亲和力较TfR-scFv有明显的提高。

全文目录


英文缩略词  5-6
中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
前言  10-13
技术路线  13-14
材料  14-19
方法  19-26
结果  26-37
讨论  37-40
参考文献  40-42
小结  42-43
综述  43-54
  参考文献  50-54
致谢  54

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤免疫学与血清学
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