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丙草胺和乙草胺的酶联免疫吸附分析方法研究

作　者: 余鹏敏
导　师: 王鸣华
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: 丙草胺 乙草胺 半抗原 多克隆抗体 ELISA
分类号: S482.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本论文以除草剂丙草胺和乙草胺为研究对象,合成了丙草胺半抗原(PMPA)和乙草胺半抗原(APMA),采用碳二亚胺法将半抗原与牛血清蛋白BSA偶联获得免疫抗原,采用混合酸酐法将半抗原与卵清蛋白OVA偶联获得包被抗原,并免疫新西兰大白兔,获得相应的多克隆抗体。当包被抗原的浓度为4 mg/L时,丙草胺和乙草胺的抗体的效价分别达1.02×106和2.56 x 105。通过方阵滴定法筛选ELISA包被抗原和抗体的最适工作浓度,进一步研究了有机溶剂、离子强度和pH值等因素对间接竞争ELISA法的影响,确定了丙草胺和乙草胺ic-ELISA法的最佳条件。丙草胺ELISA法的最佳条件：包被原和抗体的最适工作浓度分别为0.5 mg/L和1 mg/L,免疫反应体系为10%的甲醇含量、pH 7.5以及离子强度0.14mol/L的磷酸盐缓冲溶液；乙草胺ELISA法的最佳条件：包被原和抗体的最适工作浓度分别为1 mg/L和2 mg/L,免疫反应体系为不含有机溶剂、pH 7.5和0.4mol/L的离子强度的磷酸盐缓冲溶液。在优化的条件下,以Logit(B/B0)为纵坐标与待测物的浓度对数为横坐标建立丙草胺与乙草胺的标准曲线。在0.001～1.000 mg/L浓度范围内,Logit(B/B0)与丙草胺浓度对数呈现良好的线性关系,得回归方程y=-0.591x～0.8539,R2=0.9909,IC50为0.0415 mg/L。与乙草胺、丁草胺、吡草胺和甲霜灵这几种结构相似的农药没有明显交叉反应,方法的特异性高。在0.0255 mg/L浓度范围内,Logit(B/Bo)与乙草胺浓度对数呈现良好的线性关系,得线性回归方程y=-0.7421x-0.2996,R2=0.9902,IC50为0.3718 mg/L。该方法有着较好的特异性,对丙草胺、丁草胺、吡草胺和甲霜灵这几种结构类似物没有明显的交叉反应。以优化的ic-ELISA方法进行添加回收率实验测定,评价方法的准确度和精密度。结果表明,丙草胺添加浓度在0.05～5 mg/L,方法在水样的回收率和变异系数分别为77.0～115.2%和2.3～9.4%；土壤中添加浓度0.1、0.5和1mg/kg,其回收率和变异系数分别为79.1～92.3%和4.0～8.4%。乙草胺添加浓度在0.1～10 mg/L,方法在水样的添加回收率和变异系数为73.2～117.6%,变异系数在3.2～6.4%之间；添加浓度在0.1～1mg/kg范围内,方法在土壤、玉米和大豆中的添加回收率和变异系数分别为77.3～98.6%和1.7～9.2%。水样用缓冲液PBS稀释10倍后检测可有效消除基质效应。建立的ELISA方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求,适用于对水体、土壤以及农产品中丙草胺和乙草胺的快速残留分析,具有较高的实用价值。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略语  11-12第一章 文献综述  12-28  1 半抗原分子设计的一般策略  12-17    1.1 半抗原的设计原则  12-13    1.2 分子模拟  13-17  2. 农药酶联免疫吸附分析(ELISA)方法的建立  17-22    2.1 农药酶联免疫分析方法的类型  17-19    2.2 酶联免疫分析方法测定条件的优化  19-20    2.3 酶联免疫分析方法的基质效应和样品制备  20    2.4 酶免疫分析技术质量控制  20-22  3. 氯乙酰胺类除草剂免疫分析现状和进展  22-27    3.1 简介  22    3.2 半抗原的基本设计策略  22-24    3.3 酶联免疫分析现状  24-25    3.4 免疫分析新技术的应用  25-27  4. 本研究的目的和意义  27-28第二章 丙草胺的酶联免疫吸咐分析技术研究  28-46  1 引言  28  2 材料与方法  28-35    2.1 材料与试剂  28-30    2.2 半抗原的合成  30    2.3 人工抗原的合成以及偶联结合比的测定  30-31    2.4 抗体的制备和纯化  31-33    2.5 最适工作浓度的测定  33    2.6 间接竞争ELISA程序  33    2.7 条件优化及标准曲线的建立  33-34    2.8 交叉反应率测定  34    2.9 添加回收测定  34-35  3. 结果与分析  35-42    3.1 半抗原分子的结构鉴定  35-37    3.2 人工抗原偶联物结合比的测定  37-38    3.3 多克隆抗体的效价和工作浓度选定  38    3.4 丙草胺ELISA法的影响因素  38-40    3.5 丙草胺的标准曲线  40    3.6 交叉反应  40-41    3.7 添加回收率的测定  41-42  4. 讨论  42-46    4.1 半抗原设计  42-43    4.2 ic-ELISA分析条件的优化  43-44    4.3 准确度和精密度  44    4.4 特异性分析  44-46第三章 乙草胺的酶联免疫吸咐分析技术研究  46-62  1. 引言  46  2. 材料与方法  46-52    2.1 材料与试剂  46-48    2.2 半抗原的合成  48    2.3 人工抗原的合成以及偶联结合比的测定  48-49    2.4 抗体的制备和纯化  49-51    2.5 最适工作浓度的测定  51    2.6 间接竞争ELISA程序  51    2.7 条件优化及标准曲线的建立  51-52    2.8 交叉反应率的测定  52    2.9 添加回收测定  52  3. 结果与分析  52-59    3.1 半抗原分子的结构鉴定  52-54    3.2 人工抗原偶联物结合比的测定  54    3.3 多克隆抗体的效价和工作浓度选定  54-55    3.4 乙草胺ELISA法的影响因素  55-56    3.5 乙草胺的标准曲线  56-57    3.6 交叉反应  57-58    3.7 添加回收率的测定  58-59  4. 讨论  59-62    4.1 ic-ELISA分析条件的优化  59    4.2 灵敏度和特异性分析  59    4.3 准确度和精密度  59-62全文主要结论  62-64参考文献  64-74附录  74-76致谢  76-78攻读硕士期间发表的论文  78

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 各种农药 > 除草剂（杀草剂）
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