学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
根癌农杆菌LBA4404介导的微紫青霉菌菌株GXCR遗传转化体系的建立
作 者: 玉荣
导 师: 李有志
学 校: 广西大学
专 业: 微生物学
关键词: 微紫青霉菌菌株GXCR 重金属抗性机制 苯菌灵抗性 根癌农杆菌 遗传转化
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2008年
下 载: 224次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
从基因水平来研究丝状真菌与重金属间的相互作用具有重要的意义,近年来发展的根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)与传统的遗传转化方法相比较,ATMT具有高效、稳定、高频单拷贝随机插入、适用范围广等优点,是目前研究丝状真菌遗传转化的主要手段之一。基于本实验室工作曾分离得到一株高抗多种重金属盐并对苯菌灵敏感的微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)菌株GXCR的良好基础,研究将建立由根癌农杆菌LBA4404介导的GXCR菌株的遗传转化体系,为从基因水平上研究该菌株对重金属盐抗性的可能机制提供基础。本研究在质粒pGSA1252基础上构建了T-DNA区含有苯菌灵抗性基因(Benomylresistance)的双元载体pG-Bn,通过三亲转化法导入到根癌农杆菌LBA4404中,与稀释至107个/ml的GXCR孢子共培养两天后筛选得到具有苯菌灵抗性的转化株367株,对随机挑取的40株转化株总DNA进行PCR验证,有98%的转化株均能扩增出目的片段,转化效率达到了3.7个转化株/10个小菌块。随机挑选30个能扩增出目的片段的转化株中,有13个转化株不能在CuSO4 PDA平板上生长,9个转化株的生长明显受CuSO4抑制。同时对表型明显发生变化的转化株总DNA进行Southern杂交分析,结果显示62.5%的转化株为T-DNA单拷贝整合插入,易于利用插入突变来分析相关基因的功能,为对微紫青霉菌菌株GXCR的抗重金属遗传机制的研究提供了宝贵的材料。
|
全文目录
摘要 4-6 ABSTRACT 6-11 第一章 前言 11-27 1.1 丝状真菌与重金属的相互作用 11-13 1.1.1 重金属污染现状 11-12 1.1.2 重金属污染的特点 12 1.1.3 重金属与丝状真菌的相互作用 12-13 1.2 丝状真菌遗传转化方法的研究进展 13-21 1.2.1 CaCl_2/PEG介导的原生质体(Protoplasts/PEG)转化法 15-16 1.2.2 电穿孔(Electroporation)转化法 16 1.2.3 醋酸锂(Lithium Acetate)转化法 16-17 1.2.4 转座子标签技术(Transposon tagging) 17 1.2.5 脂质体(Liposome)转化法 17 1.2.6 基因抢(Biolistics)转化法 17-18 1.2.7 限制性酶介导插入突变转化法(Restriction enzyme-mediated insertional,REMI) 18 1.2.8 激光(Laser)诱导融合法 18 1.2.9 根癌农杆菌介导的转化法(Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation.ATMT) 18-21 1.3 根癌农杆菌介导遗传转化体系的原理和优点 21-24 1.3.1 根癌农杆菌介导的遗传转化体系的主要原理 21-23 1.3.2 根癌农杆菌介导的遗传体系的优点 23-24 1.4 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的应用 24-26 1.4.1 利用基因敲除研究基因功能 25-26 1.4.2 利用基因插入突变标记克隆相关基因 26 1.5 本研究的目的意义 26-27 第二章 材料与方法 27-43 2.1 材料 27-33 2.1.1 菌株和载体质粒 27 2.1.2 抗生素及使用浓度 27-28 2.1.3 培养基及其各菌株培养条件 28-30 2.1.4 使用试剂 30-31 2.1.5 溶液与缓冲液 31-32 2.1.6 实验中用到的主要仪器与设备 32-33 2.1.7 本实验所用到的引物 33 2.2 方法 33-43 2.2.1 质粒DNA的提取 33-34 2.2.2 DNA的酶切反应 34 2.2.3 DNA片段的回收 34 2.2.4 DNA的连接反应 34-35 2.2.5 质粒DNA的热击转化 35-36 2.2.6 PCR反应 36 2.2.7 PCR产物回收 36-37 2.2.8 PCR产物的克隆 37 2.2.9 DNA的测序 37 2.2.10 三亲结合法将构建好的载体导入根癌农杆菌LBA4404 37 2.2.11 根癌农杆菌质粒DNA的提取 37-38 2.2.12 冻融法将重组质粒DNA导入根癌农杆菌LBA4404 38-39 2.2.13 根癌农杆菌Ti质粒介导的转化 39 2.2.14 微紫青霉菌(Penicillium janthinillum)菌株GXCR转化株总DNA的提取 39-40 2.2.15 转化株总DNA的PCR验证 40 2.2.16 转化株的遗传稳定性检测 40 2.2.17 转化株的抗重金属能力变化分析 40-41 2.2.18 Southern杂交 41-43 第三章 结果与分析 43-59 3.1 载体的构建 43-51 3.1.1 载体、质粒的酶切位点分析和引物的获得 43-46 3.1.2 抗苯菌灵基因片段的获得 46-47 3.1.3 抗苯菌灵基因片段连接到中间载体pGEM-3zf(+) 47-49 3.1.4 将抗苯菌灵基因片段连接到表达载体pGSA1252 49-50 3.1.5 将构建好的双元载体导入根癌农杆菌LBA4404中 50-51 3.2 根癌农杆菌介导微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)菌株GXCR转化体系的建立 51-59 3.2.1 含有构建好的双元载体的根癌农杆菌LBA4404与微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)菌株GXCR孢子的共培养 51-52 3.2.2 转化突变株的筛选结果 52-54 3.2.3 转化株总DNA的PCR验证 54 3.2.4 转化株稳定性检测 54 3.2.5 转化突变株对硫酸铜CuSO_4的抗性能力分析 54-58 3.2.6 转化株Southern杂交分析 58-59 第四章 讨论 59-61 参考文献 61-72 致谢 72-73 攻读硕士学位期间论文发表情况 73
|
相似论文
- 利用RNAi提高烟草对病毒的抗性及岷江百合遗传转化体系的初步构建,S435.72
- rd29A驱动RdreBlBI基因转化‘红颊’草莓的研究,S668.4
- 新疆紫草细胞的稀土生物学效应及遗传转化,S567.239
- 新疆小麦1Dx5基因的分离克隆及表达载体构建,S512.1
- 大豆GmFtsH基因的遗传转化及功能分析,S565.1
- 野生种马铃薯蛋白酶抑制剂基因CYS和API的克隆及SpCYS转化马铃薯和烟草的初步研究,S532
- 蝴蝶兰花序分生组织基因LFY表达载体构建及对蝴蝶兰的遗传转化,S682.31
- 切花菊转DdICE1基因研究,S682.11
- 切花菊蚜虫抗性鉴定与机理探讨及LLA转基因研究,S682.11
- 枣叶片再生途径的组织学研究及影响遗传转化因素的分析,S665.1
- 转attM基因彩色马蹄莲及AttM解酯酶抗体制备研究,S682.264
- ‘突尼斯软籽’石榴再生体系和GFP报告基因的瞬时表达研究初报,S665.4
- 野生茄子托鲁巴姆黄萎病抗性相关基因StPGIP功能鉴定,S572
- 3GT基因转化马铃薯的研究,S532
- 拟南芥MAP65-6和TUA-6基因转化烟草的初步研究,Q943.2
- 花期可控型菊花新种质的研究,S682.11
- 小麦avenin-likeb基因胚乳特异性表达载体的构建和遗传转化,S512.1
- 枝状枝孢霉MD2基因工程菌株的构建,Q93
- 小麦TaCBL3基因的克隆及其遗传转化,S512.1
- 小麦籽粒硬度基因Pin的RNAi载体构建和遗传转化,S512.1
- 小麦WRKY基因的克隆、表达分析及其遗传转化,S512.1
中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
© 2012 www.xueweilunwen.com
|