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HPV16L1\E7 L2\E7疫苗构建及在毕赤酵母中的表达和HPV16L1\E7疫苗的免疫原性的初步研究

作　者: 李鹏道
导　师: 张迎梅
学　校: 兰州大学
专　业: 动物学
关键词: 人类乳头瘤病毒 宫颈癌 L1 L2 E7 毕赤酵母 表达 免疫原性
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


宫颈癌是女性死于恶性肿瘤的重要因素。研究证明90%左右的宫颈癌的组织可以检测到HPV16亚型,HPV16型与鳞癌有着密切关系,而90%的宫颈癌为鳞癌,所以HPV16是女性宫颈癌发病的主要原因。巴斯德毕赤酵母表达系统是现目前广泛应用的异源蛋白真核表达系统,其具有稳定性好、表达高效、分泌量大、规模化容易和成本低廉等优点,且具有糖基化等翻译后修饰功能。本研究主要开展了以下几方面工作：①克隆HPV16 L1/E7和L2/E7基因及构建质粒pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L2/E7;②将构建成功的真核表达质粒pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L2/E7转化毕赤酵母,筛选稳定高效分泌表达菌株；③在80L发酵罐规模下建立了HPV16L1/E7发酵工艺；④研究该疫苗的免疫原性和抗肿瘤效果。主要研究结果如下：一、HPV16L1、L2和E7基因的克隆及质粒pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L2/E7的构建利用特异性引物,通过PCR方法获得编码HPV16L1、L2和E7蛋白的基因序列。将获得的基因序列克隆到pPIC9k载体上,建立了pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L2/E7克隆质粒,经酶切鉴定和测序鉴定方法验证,证明克隆质粒构建成功。二、稳定高效分泌表达毕赤酵母菌种的筛选与鉴定1.毕赤酵母感受态的制备及电转化(按照毕赤酵母表达手册操作进行)。确定构建成功的pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L1/E7表达质粒,经相应酶切鉴定和测序证实后,线性化重组质粒,电转化毕赤酵母菌株GS115。2.重组毕赤酵母菌种的筛选。在MM和MD培养基上确定其生长表型；然后用2.0mg/ml浓度的G418筛选高拷贝的菌株,提取其基因组DNA作模板,进行PCR鉴定。3. HPV16L1/E7和HPV16L2/E7的表达与鉴定。取PCR鉴定阳性的转化子于28℃摇床培养扩增,0.5%甲醇诱导表达,分别用SDS-PAGE、Western blot检测了表达蛋白。实验结果显示只有HPV16-L1/E7融合蛋白得到成功表达,WESTERN-BLOT显示在出现正确的特异条带并有较好的抗原性,与推导的蛋白条带大小一致,说明在毕赤酵母表达系统中成功的表达了pPIC9k-L1/E7蛋白。而pPIC9k-L2/E7蛋白却未表达成功。经测定重组HPV16L1/E7蛋白疫苗表达量为50ng/ul。4.外源蛋白表达单一实验条件优化。毕赤酵母对外源蛋白的表达受很多因素的影响,但主要是pH值、甲醇浓度和诱导时间,所以本研究从这三个方面进行了实验的优化。实验结果表明该外源蛋白在毕赤酵母中的表达在pH值为6.0、诱导时间为60小时和甲醇浓度为0.5%的时候表达最为显著。三、融合蛋白的免疫原性和抗肿瘤方面进行了初步研究1.为检测HPV16-L1/E7融合蛋白的免疫原性,实验中用纯化的融合蛋白免疫C57BL/6小鼠,然后检测其诱导产生的体液和细胞免疫反应。结果说明该蛋白疫苗具有很好的免疫性,产生了能够维持较长时间和较高滴度的抗血清,表明能够诱发小鼠机体的体液免疫。2.为研究疫苗的预防性效果,本研究先对小鼠注射蛋白疫苗免疫,然后荷瘤。结果显示,免疫了重组蛋白疫苗的那组,肿瘤生长缓慢质量小,平均肿瘤质量为2.08g；而佐剂对照组生长快质量大,平均质量为2.99g。3.对小鼠的治疗性免疫效应中,本研究先对小鼠荷瘤,等肿瘤长到一定大小,然后给小鼠注射疫苗免疫。结果显示小鼠免疫了重组蛋白疫苗的一组得到较明显的抑制肿瘤发展的效果,平均肿瘤质量为2.57g；而注射PBS的一组没有抑瘤作用,平均肿瘤质量为3.03g。综上所述,说明HPV16 L1/E7蛋白疫苗对宫颈癌具有良好的预防和治疗效果,这一研究结果为宫颈癌及相关疾病的治疗及相关药物的研发奠定了基础。

全文目录


中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
英文缩略词  11-12
前言  12-24
  一 宫颈癌和HPV  12-17
    1. HPV的亚型  13
    2. HPV的结构与功能  13-15
    3. HPV疫苗的研究进展  15-17
  二 巴斯德毕赤酵母表达系统  17-24
    1. 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点  17-18
    2. 与其他表达系统的比较  18
    3. 巴斯德毕赤酵母的菌株和表达载体  18-24
第一章 HPV16PPIC9K-L1/E7_L2/E7疫苗的构建  24-33
  一 材料仪器与试剂  24-25
    1. 材料  24-25
    2. 常用溶液及配置  25
  二 实验方法  25-30
    1. 引物设计  25-26
    2. 基因扩增  26-27
    3. 扩增产物的回收  27
    4. pPIC9k-L1/E7和pPIC9k-L2/E7重组子的构建与质粒提取  27-30
    5. 质粒的线性化  30
  三 实验结果  30-32
    1. 目的基因的PCR扩增  30-31
    2. 重组质粒与酶切鉴定  31-32
  四 小结  32-33
第二章 HPV16-L1/E7_L2/E7疫苗在毕赤酵母中的诱导表达及纯化  33-47
  一 材料试剂  33-35
    1. 主要仪器  33
    2. 主要试剂和溶液  33-35
  二 操作方法  35-42
    1. 毕赤酵母感受态的制备及电转化  35-36
    2. 重组酵母GS115阳性转化子的高拷贝外源基因整合筛选及鉴定  36-37
    3. 重组蛋白的诱导表达  37-40
    4. 目的蛋白的规模化发酵  40-41
    5. 表达产物的小量纯化  41-42
  三 实验结果  42-45
    1. PCR鉴定重组子  42-43
    2. 表型筛选  43
    3. SDS-PAGE和Western-blot电泳检测表达产物及表达量的检测  43-44
    4. 甲醇浓度对HPV16型pPIC9k-L1/E7融合蛋白的诱导情况  44
    5. PH值对HPV16型pPIC9k-L1/E7融合蛋白的表达影响  44-45
    6. HPV16型pPIC9k-L1/E7融合蛋白最佳诱导时间的确定  45
  四 小结  45-47
第三章 HPV16-L1/E7融合蛋白免疫原性和抗肿瘤的初步研究  47-53
  一 材料试剂  47
    1. 细胞株  47
    2. 实验动物  47
    3. 试剂和器材  47
  二 实验方法  47-49
    1. 动物的免疫  47-48
    2. 抗血清检测  48
    3. 淋巴细胞增殖实验  48-49
    4. 抗肿瘤实验  49
    5. 数据处理  49
  三 实验结果  49-52
    1. 抗血清的检测  49-50
    2. 淋巴细胞的增殖情况  50
    3. 抗肿瘤实验  50-52
  四 小结  52-53
第四章 讨论  53-56
结论  56-57
参考文献  57-66
致谢  66

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学 > 免疫生物学
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