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山羊BMPR-ⅠB基因的PCR-SSCP分析及繁殖力相关基因的差异表达

作　者: 钱丽丽
导　师: 贾青
学　校: 河北农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 山羊 BMPR-ⅠB PCR-SSCP DDRT-PCR 繁殖力基因表达卵巢
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 72次
引　用: 1次
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内容摘要

山羊的多羔性属于繁殖性状,遗传力较低,仅依靠常规育种难以提高,分子育种的出现为加快繁殖性状的选育提供了有效途径。目前有关山羊繁殖力的分子水平方面的研究主要围绕已知候选基因,其中骨形态发生蛋白受体ⅠB(BMPR-ⅠB)基因是在绵羊中发现的第一个控制繁殖力的主效基因。该基因高度保守的胞内激酶信号区域的A746G突变与Booroola母羊高繁殖力完全相关。为了检测河北中部地区的本地山羊群体中是否也存在此类突变,应用特定引物扩增了包含746位点的140bp的片段,利用SSCP技术检测该位点在供试山羊不同繁殖力群体(高产群22只,低产群23只,和普通群78只共123只)中的多态性。结果发现,供试山羊群体的BMPR-ⅠB基因不存在A746G突变。这表明BMPR-ⅠB基因中影响Booroola绵羊的A746G突变位点对该地方山羊的高繁殖力没有影响。为了查找与山羊高繁殖力相关的新基因或EST序列,应用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)技术,以12只地方山羊为材料,按其繁殖记录分为高产、低产两组,分析了山羊在发情期卵巢组织基因表达的差异。结果在聚丙烯酰胺凝胶检测中得到30条差异片段,再经二次PCR扩增得到12条差异片段,最终经反Northern鉴定在其中4条片段中存在表达量差异。经克隆测序后利用半定量PCR方法对差异片段进行了再次的验证。所得序列提交到GenBank中并应用BLAST与NCBI数据库中的已知序列进行比对,其中有1条序列与牛的PCNP的mRNA序列的相似性为94%,推断该片段所属基因应属于PCNP基因。应用比较基因组学和生物信息学方法对NCBI中已有的牛、人、家鼠等8个物种的PCNP基因的完整CDS序列及其编码的氨基酸序列进行了比对分析。并应用ProtParam、SCOPMA、SMART等在线分析软件对牛的PCNP基因编码的氨基酸序列进行了理化性质、二级结构等的预测。结果显示PCNP基因的核酸及其编码的氨基酸序列都是比较保守的,预测该蛋白是一种稳定性不高的亲水性核蛋白,可能参与细胞增殖调控。另1条与野猪中获得的克隆片段THY010003E05一致性为81%,但功能未知。其余两条为新发现的表达片段,在NCBI中未发现高度同源序列。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-16
  1.1 前言  9-10
  1.2 山羊繁殖性能研究概况  10-12
  1.3 BMPR-ⅠB 基因研究进展  12-13
  1.4 DDRT-PCR 技术应用进展  13-15
  1.5 小结  15-16
2 材料与方法  16-30
  2.1 试验材料  16-20
    2.1.1 试验山羊来源与采样方法  16
    2.1.2 药品和酶  16-17
    2.1.3 试验仪器设备  17
    2.1.4 试剂配制  17-20
    2.1.5 分析工具软件  20
  2.2 试验方法  20-30
    2.2.1 山羊血液组织中DNA 的提取与检测  20-21
    2.2.2 BMPR-ⅠB 基因部分序列的单核苷酸多态性分析  21-22
    2.2.3 山羊卵巢组织 RNA 的提取、纯化及检测  22-24
    2.2.4 应用 DDRT 技术分离差异表达的基因片段  24-25
    2.2.5 差异表达序列片段的回收和反式 Northern 杂交检测  25-27
    2.2.6 差异表达片段的克隆、测序及同源性分析  27-28
    2.2.7 表达量差异片段的半定量测定  28-29
    2.2.8 核酸及氨基酸序列的生物信息学分析  29-30
3 结果与分析  30-43
  3.1 山羊血液样品基因组DNA 的提取结果  30
  3.2 BMPR-ⅠB 基因部分序列单核苷酸多态性分析  30-31
    3.2.1 BMPR-ⅠB 基因目的片段的PCR 扩增  30
    3.2.2 BMPR-ⅠB 基因的PCR-SSCP 分析  30-31
    3.2.3 扩增片段测序结果比对分析  31
  3.3 不同物种BMPR-ⅠB 基因的多态信息分析结果  31-32
  3.4 山羊卵巢组织RNA 提取结果  32-33
  3.5 DDRT-PCR 差异显示结果  33-34
  3.6 差异片段回收及反Northern 检测结果  34-36
    3.6.1 差异条带的二次扩增  34
    3.6.2 反式 Northern 杂交检测  34-35
    3.6.3 差异表达的cDNA 稳定条带的统计  35-36
  3.7 差异条带克隆测序及同源性比对结果  36-38
    3.7.1 差异表达条带的克隆测序  36-37
    3.7.2 差异片段的同源性分析结果  37-38
  3.8 PCNP 基因的半定量检测  38-39
  3.9 PCNP 的生物信息学分析  39-43
    3.9.1 PCNP 基因CDS 序列多态信息分析  40
    3.9.2 PCNP 的氨基酸序列同源比对  40-41
    3.9.3 山羊PCNP 基因的功能预测  41-43
4 讨论  43-49
  4.1 BMPR-ⅠB 基因与山羊繁殖性能的关系  43-44
  4.2 PCNP 与动物繁殖性能的关系  44-45
  4.3 各因素对研究结果的影响  45-48
    4.3.1 试验材料  45-46
    4.3.2 样品的采集及处理  46
    4.3.3 检测技术  46-48
  4.4 有待进一步研究的问题  48-49
5 结论  49-50
参考文献  50-54
在读期间发表论文  54-55
作者简历  55-56
致谢  56-57

山羊BMPR-ⅠB基因的PCR-SSCP分析及繁殖力相关基因的差异表达

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