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水稻pib基因内含子1、2对Pib启动子活性影响的转基因分析
作 者: 李江涛
导 师: 杨世湖
学 校: 南京农业大学
专 业: 作物遗传育种
关键词: 水稻 基因表达 内含子 暗诱导
分类号: S511
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea Barr[无性世代为Pyricularia grisea Saco.]所引起的真菌性水稻病害(Herbert,1971),与纹枯病、白叶枯病并称为水稻的三大主要病害;几乎在每个栽培水稻的国家和地区都有此病发生,只要条件适宜,就容易流行成灾,甚至颗粒无收。培育抗病品种是解决这一难题的关键,通过基因工程的方法将抗病基因导入感病水稻品种,对水稻抗病育种有着十分重要的理论意义和应用价值。Pib基因是水稻中第一个被克隆的抗稻瘟病基因,属于NBS-LRR抗病基因家族。在NCBI (美国国家生物技术信息中心)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov对pib基因进行搜索,找到已经公布的pib基因核苷酸序列及该基因的相应分析。分析表明,pib基因10322 bp长DNA片段包含了5.4kb左右完整的结构基因(ORF)、3573bp的ATG上游区段和1000多bp的下游区段。pib是一个有4个内含子、5个外显子的分裂基因,其中两个内含子在起始密码之前。根据Pib基因的结构特点,本研究以pib基因3’端缺失启动子融合报告基因的构建方式来分析内含子对pib启动活性和暗诱导活性的影响,相应载体分别命名为pNAR1101、pNAR1102和pNAR1103。以农杆菌介导的方法转化中感稻瘟病水稻品种R109,共获得98株转基因植株。其中pNAR1101的转化植株32株,pNAR1102的转化植株30株,pNAR1103的转化植株36株。经PCR、Southern blot分析表明,Pib基因片段已经整合到R109的基因组中,且全部为单拷贝。对上述不同长度3’端缺失的pib启动子驱动gus基因的水稻转基因植株,进行Gus荧光定量分析,系统研究了pib启动子中内含子的缺失对与启动子启动活性和暗诱导性的影响。荧光定量分析结果表明,这两个内含子及相邻pib启动子下游3’端序列缺失都不能使pib启动子丧失其启动活性和暗诱导活性,但随着内含子的被敲除,不仅pib启动子的启动活性明显下降,而且其暗诱导活性也明显下降,这些结果表明,这两个内含子具有增强启动子启动活性和暗诱导活性的功能,这也说明内含子不仅能参与结构基因转录后的再剪接,一些内含子也能参与启动子启动活性和启动子内含的暗诱导元件诱导活性的调节。
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全文目录
摘要 7-9ABSTRACT 9-11缩略语 11-13第一章 文献综述 13-33 第一节 水稻稻瘟研究进展 13-19 1 稻瘟病研究的历史 14 2 稻瘟病的症状及发病规律 14-15 3 稻瘟病菌侵染与为害机理 15 4 稻瘟病造成的危害 15 5 抗稻瘟病基因研究进展 15-19 5.1 稻瘟病抗性基因遗传分析与分子定位 16-17 5.2 稻瘟病抗性基因的克隆 17-18 5.2.1 传统图位克隆 17-18 5.2.2 电子图位克隆 18 5.3 Pib基因的克隆及研究进展 18-19 第二节 水稻遗传转化研究 19-27 1 水稻转化受体系统 20-21 1.1 原生质体再生系统 20 1.2 愈伤组织再生系统 20 1.3 幼嫩子房转化系统 20-21 2 常用的基因转化方法 21-24 2.1 农杆菌介导法(Agrobacterium-mediation) 21-22 2.2 基因枪转化法(Biolistics) 22 2.3 聚乙二醇法(PEG,Polyethylene Glycol) 22-23 2.4 电激法(Elect roporation) 23 2.5 花粉管通道法(pollen tube-pathway transformation) 23 2.6 其他方法 23-24 3 水稻转化中报告基因的选择 24-25 4 植物基因工程存在的问题及展望 25-27 4.1 基因沉默 25 4.2 外源基因在转基因植物中的最佳表达及其遗传稳定性 25-26 4.3 选择标记基因的去除 26 4.4 转基因品种与常规品种的安全性 26-27 第三节 植物基因内含子的研究 27-30 1 植物基因内含子的结构特征 27-28 2 内含子对基因表达的调控作用 28-30 2.1 内含子对基因表达的正调控作用 28-29 2.1.1 内含子可能具有启动子的功能 28-29 2.2 内含子对基因表达的负调控作用 29-30 2.3 内含子对基因表达的双向调节作用 30 3 内含子突变对基因表达效应的影响 30 第四节 本研究的目的和意义 30-33第二章 植物表达载体的构建 33-41 1 材料和方法 33-36 1.1 实验材料 33-34 1.1.1 质粒与菌株 33-34 1.1.2 试剂与试剂盒 34 1.1.3 质粒抽提液 34 1.1.4 培养基 34 1.2 方法 34-36 1.2.1 CaCl_2法制备大肠肝菌感受态细胞的制备 34-35 1.2.2 质粒提取 35 1.2.3 酶切产物的回收(参见鼎国产品说明书) 35 1.2.4 连接反应与转化 35 1.2.5 根癌农杆菌EHA105感受态的制备和转化 35-36 2 结果与分析 36-41 2.1 对双元载体pCAMBIA1381Z的分析 37 2.2 Pib基因的酶切位点分析 37 2.3 pNAR1101的构建 37-38 2.4 pNAR1102的构建 38-39 2.5 pNAR1103的构建 39-40 2.6 双元载体转化农杆菌EHA105 40-41第三章 农杆菌介导的转基因水稻植株获得 41-49 1 材料与方法 41-45 1.1 实验材料 41-42 1.1.1 转基因受体品种 41 1.1.2 质粒和菌株 41 1.1.3 试剂和试剂盒 41-42 1.2 方法 42-45 1.2.1 水稻愈伤组织的诱导、继代培养和农杆菌转化 42-43 1.2.2 转基因水稻离体叶片潮霉素抗性鉴定 43 1.2.3 水稻基因组DNA的提取 43-44 1.2.4 转基因植株的PCR检测 44 1.2.5 水稻叶片总DNA的提取 44-45 2 结果与分析 45-49 2.1 转基因水稻植株的获得 45-46 2.2 转基因水稻叶片的离体抗潮霉素鉴定 46-47 2.3 转基因植株的PCR鉴定 47-49第四章 Pib基因启动子内含子缺失的转基因分析 49-55 1 材料与方法 49-50 1.1 实验材料 49-50 1.1.1 试剂 49 1.1.2 缓冲液 49-50 1.2 实验方法 50 2 结果与分析 50-53 2.1 不同长度pib基因启动子转基因植株的GUS活性定量分析 50-51 2.2 不同缺失体构建的转基因植株暗诱导前后Gus活性荧光定量分析 51-53 3 讨论 53-55全文总结 55-57参考文献 57-65攻读硕士期间发表的论文 65-67致谢 67
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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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