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鸡Δ~6脂肪酸脱氢酶基因启动子区域多态性及基因时空表达的研究

作　者: 卢冉
导　师: 康相涛；陈其新
学　校: 河南农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 鸡 Δ~6脂肪酸脱氢酶基因 5’非翻译区单核苷酸多态基因表达
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

营养与遗传因素间存在密切的互作关系,营养遗传学和营养基因组学是目前研究的热点之一。Δ⁶脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪生成的限速酶,而多不饱和脂肪酸在动物体内发挥着重要的生物学功能,与人和动物脂肪酸代谢紊乱症有关,也可能是畜禽肉质及其它经济性状的重要决定因素。但目前该基因结构尚不完全清楚,有关基因功能也尚未得到全面研究。因此,本试验首先利用PCR和5’RACE技术克隆了FADS2基因的5’UTR,并确定准确的转录起始位点。其次,应用混合DNA池测序技术对鸡FADS2基因启动子区域的变异位点进行了筛选,用PCR-RFLP技术分析了新筛选出的变异位点在固始鸡-安卡鸡F₂代资源群中的群体遗传特性,并与生长性状、屠体性状等经济性状及血液生化指标等进行了关联分析。另外,应用实时定量PCR对丝毛乌骨鸡FADS2基因的时空表达进行了测定。主要结果如下:1、获得了FADS2基因的完整5’UTR区域其长度为196bp,将鸡FADS2的mRNA序列向5’端延伸了48bp。通过生物信息学分析发现该基因转录起始位点上游28～22bp具有TATA框,其-641bp～+200bp区域内存在一个典型的CpG岛,另有重要的转录因子结合位点。2、在鸡FADS2启动子区域新发现了9个突变位点。应用内切酶AluⅠ、HhaⅠ对其中的2个SNP（C-958T,C-725T）在F₂代资源群中的遗传多态性进行了检测。群体遗传学表明:在C-958T位点,C、CC分别是优势等位基因和优势基因型;该位点属于中度多态（0.3308）,并处于哈代-温伯格平衡状态。在C-725T位点,C、CC分别是优势等位基因和优势基因型;该位点为低度多态（0.0891）,不符合哈代-温伯格平衡。关联分析结果表明,C-958T位点突变与体重、胫围、体斜长、胸宽、胸深、屠体重、肝脏重、肌胃重、脾脏重,血液中的谷草转氨酶、葡萄糖、甘油三酯、乳酸脱氢酶显著相关（P<0.05）。C-725T位点突变与心脏率、肌胃率、腿肌率、血液中的谷丙转氨酶、总胆固醇,肌肉中的C22:3及C22:4显著相关（P<0.05）。3、在对乌鸡公鸡1日龄,4、8、12周龄的肝脏、心脏、肌肉的的FADS2的表达研究发现,FADS2在肝脏中1日龄的表达量显著低于4、8、12周龄的表达量,心脏、肌肉在1日龄,4、8、12周龄的表达量差并不显著;而同一时间段不同组织的FADS2表达量来说,在1日龄各组织的表达量差异并不显著,而4、8、12周龄的肝脏表达量显著高于心脏、肌肉的表达量。心脏与肌肉在各阶段的表达量差异并不显著。由以上试验结果,可得出如下结论1、鸡FADS2基因准确的转录起始位点在ATG上游为196bp处。该基因启动子预测为强启动子。2、鸡FADS2基因启动子区域遗传变异丰富。其中C-958T位点与较多的生长性状、屠体性状及血液生化指标显著关联,而C-725T则与部分屠体性状、血液生化指标及肌肉中多不饱和脂肪酸显著相关。有望作为育种的分子标记辅助选择。3、丝毛乌骨鸡FADS2基因表达呈现明显的时空表达规律。肝脏是是不饱和脂肪酸代谢调控的主要器官,4周龄丝毛乌骨鸡的不饱和脂肪酸代谢已趋于成熟。

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致谢 4-9摘要 9-111 文献综述 11-19 1.1 多不饱和脂肪脂肪酸的重要功能 11-14 1.1.1 对动物生长发育的影响 11 1.1.2 PUFAS 调控脂类代谢 11-12 1.1.3 对细胞膜功能的影响 12 1.1.4 对炎症反应及免疫机能的影响 12 1.1.5 提高动物的产仔率、成活率 12-13 1.1.6 调控一些编码脂类代谢关键酶基因的表达 13 1.1.7 对肿瘤有抑制作用 13-14 1.1.8 与心血管疾病相关 14 1.1.9 提高肉质风味 14 1.2 Δ~6脂肪酸脱氢酶简介 14-15 1.3 Δ~6脂肪酸脱氢酶基因的研究进展 15-16 1.4 鸡Δ~6脂肪酸脱氢酶基因的研究进展 16 1.5 基因的结构 16-17 1.6 营养与遗传在动物生产中的应用 17 1.7 富集PUFA 畜禽产品的研究 17-192 引言 19-203 鸡FADS2 基因5’区域的克隆 20-30 3.1 试验材料 20-22 3.1.1 试验取样 20 3.1.2 主要试剂及溶液配制 20-21 3.1.3 试验仪器 21 3.1.4 引物设计与合成 21-22 3.2 试验方法 22-25 3.2.1 FADS2 5’侧翼序列的的PCR 扩增 22-23 3.2.2 FADS2 5’RACE 23-25 3.2.3 启动子区功能位点的生物信息学分析 25 3.3 试验结果与分析 25-27 3.3.1 FADS2 5’侧翼序列扩增 25-26 3.3.2 FADS2 5’RACE 26-27 3.3.3 FADS2 5’侧翼区内启动子的生物信息学分析 27 3.4 讨论 27-29 3.5 小结 29-304 固始鸡-安卡鸡 F_2代资源群 FADS2 启动子区域遗传变异的研究 30-53 4.1 试验材料 30-32 4.1.1 资源家系的组建 30-31 4.1.2 血样采集 31 4.1.3 试验主要试剂 31 4.1.4 主要溶液配制 31 4.1.5 主要仪器 31-32 4.2 试验方法 32-35 4.2.1 基因组DNA 的提取 32 4.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 32 4.2.3 DNA 混池的构建 32 4.2.4 SNP 位点的筛选 32-33 4.2.5 引物的设计和合成 33 4.2.6 引物稀释 33 4.2.7 PCR 扩增 33-34 4.2.8 PCR 产物的检测 34 4.2.10 酶切片段的检测 34 4.2.11 测序验证 34 4.2.12 统计分析 34-35 4.3 结果与分析 35-50 4.3.1 PCR 结果的检测 35-36 4.3.2 酶切检测 36-37 4.3.3 测序结果 37-38 4.3.4 群体遗传分析结果 38 4.3.5 FADS2 基因型与资源群经济性状关联分析结果 38-50 4.4 讨论 50-52 4.5 小结 52-535 鸡FADS2 基因在不同组织以及不同生长阶段的表达规律 53-59 5.1 试验材料 53-54 5.1.1 试验动物与来源 53 5.1.2 饲养管理 53 5.1.3 样品的采集 53 5.1.4 试验主要试剂及溶液配制 53 5.1.5 试验仪器 53-54 5.2 试验方法 54-55 5.2.1 总RNA 提取 54 5.2.2 RNA 浓度的测定 54 5.2.3 反转录 54 5.2.4 引物设计 54-55 5.2.5 荧光定量 PCR 反应操作步骤 55 5.2.6 数据处理 55 5.3 结果与分析 55-57 5.3.1 RNA 检测结果 55 5.3.2 反转录 CDNA 扩增结果 55-56 5.3.3 定量 PCR 检测结果 56 5.3.4 FADS2 在不同生长阶段乌鸡公鸡在肝脏、心脏、肌肉中的表达结果 56-57 5.4 讨论 57-58 5.5 小结 58-59参考文献 59-64ABSTRACT 64-65

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