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苏钟猪TLR4基因多态性及编码区C1027A功能分析

作　者: 刘筱
导　师: 任守文；刘红林
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 苏钟猪 TLR4 PCR-SSCP LPS 促炎症因子
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)作为一种重要的模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs),能够特异性识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),激发动物天然免疫和获得性免疫的早期免疫反应。TLR4 (Toll-like receptor 4)是TLRs受体家族中的一员,属于Ⅰ型跨膜受体蛋白,由胞外区、跨膜段和胞内区三部分组成。它是机体对革兰氏阴性菌表达的LPS应答的主要受体,在LPS跨膜信号转导中发挥主导作用。TLR4特异性识别LPS,经MyD88依赖和MyD88非依赖两条信号途径转导,最终导致NF-κB的激活,引起各种炎症因子基因的表达。目的：TLR4基因作为重要的免疫相关基因,其多态性与动物对病原的免疫力有着明显相关性。本实验主要研究苏钟猪TLR4基因的多态性及其编码区1027bp处突变对TLR4蛋白功能的影响。方法：运用PCR-SSCP方法检测TLR4基因在苏钟猪中的多态性,探讨不同基因型在该群体中的分布规律；利用Real-time PCR方法检测编码区1027bp位点不同基因型(CC型和AC型)的猪肺泡巨噬细胞在LPS诱导后,TLR2,4及促炎症因子TNF-α,IL-1β基因表达量的差异,讨论该处突变对TLR4识别LPS造成的影响。结果：1本实验在TLR4基因编码区上共找到3个非同义SNP突变点：T611A、G962A和C1027A,均位于TLR4基因第三外显子,LRRs功能域上。这些非同义突变导致编码氨基酸的变化,其中611bp (Leu204His)和1027bp (Gln343Lys)两个突变导致氨基酸性质发生改变,电荷量增加。在整个群体中,只有1027bp位点为中度多态位点,其余各突变点均为低度多态。2 LPS能快速诱导猪肺泡巨噬细胞中TLR4表达,200 ng/ml的LPS作用20 min后,TLR4 mRNA表达水平显著升高(P<0.01),48 h内都维持在较高水平。LPS还能引起促炎症因子TNF-α和IL-1β表达量上调,但TNF-αmRNA表达量的升高先于IL-1β。3 TLR4基因编码区1027bp位点不同基因型(CC型和AC型)的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)对LPS的敏感性及反应强度存在显著性差异。TLR4 mRNA表达量在LPS刺激20 min时即出现显著差异(P<0.001),直到12h CC组的TLR4表达水平都显著高于AC组；促炎症因子TNF-αmRNA的表达量的显著性差异出现在20 min(P<0.001),而在相同时间内,CC型开始显著升高时(1h),AC型该基因的表达水平已达到其5倍以上(P<0.05)；而IL-1β表达量的差异出现较迟,12h后才出现显著差异(P<0.05),但差异持续时间较长,48 h时AC组仍然显著高于CC组(P<0.01)。结论：1苏钟猪TLR4基因编码区的序列相对保守、多态含量较低,群体遗传变异程度较小。2 TLR4基因编码区C1027A能影响TLR4识别LPS的能力。在LPS诱导过程中CC型猪肺泡巨噬细胞TLR4基因表达水平上调速度高于AC型,对LPS的敏感性高；而促炎症因子TNF-α, IL-1β的表达量低于AC型,炎症反应程度轻、时间较短。TLR4基因编码区1027bp处等位基因C可能为苏钟猪抗革兰阴性菌感染的优势基因。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10缩略语  10-11引言  11-12第一部分 文献综述  12-28  第一章 TOLL样受体4研究进展  12-24    1 TLRs基因家族  12-15      1.1 TLRs的组成和结构  12-13      1.2 TLRs的配体  13-14      1.3 TLRs的信号转导通路  14-15    2 TOLL样受体4(TLR4)的特性和功能  15-24      2.1 TLR4基因序列和结构  15-16      2.2 TLR4与LPS  16-18      2.3 细胞因子与炎症反应  18-20      2.4 TLR4基因多态性与疾病的易感性  20-24  第二章 分子标记辅助选择  24-28    1 分子标记辅助选择  24    2 PCR-SSCP  24-27      2.1 PCR-SSCP的基本原理  24-25      2.2 PCR-SSCP的特点  25      2.3 PCR-SSCP的应用  25      2.4 PCR-SSCP的改进  25-27    3 本实验的目的与意义  27-28第二部分 实验研究  28-54  第一章 苏钟猪TLR4基因多态性检测  28-42    1 实验材料  28-37      1.1 实验动物  28      1.2 实验材料  28-31      1.3 试验方法  31-36      1.4 数据统计与分析  36-37    2 结果  37-40      2.1 苏钟猪TLR4基因多态性分析  37-39      2.2 群体遗传学分析  39-40    3 讨论  40-42  第二章 苏钟猪TLR4基因C1027A功能分析  42-54    1 实验材料  42-47      1.1 实验动物  42      1.2 实验材料  42-44      1.3 试验方法  44-47      1.4 数据统计与分析  47    2 结果  47-52      2.1 猪肺泡巨噬细胞的获取及细胞总RNA的提取  47-48      2.2 CC组TLR2,4及细胞因子TNF-α,IL-1β转录水平检测  48-49      2.3 AC组TLR2,4及细胞因子TNF-α,IL-1β转录水平检测  49-50      2.4 CC组与AC组TLR2,4及细胞因子TNF-α,IL-1β转录水平比较  50-52    3 讨论  52-54全文结论  54-56参考文献  56-64附录  64-68致谢  68

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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