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靶向奶山羊BLG的慢病毒RNAi表达载体的构建及转基因细胞系的建立

作　者: 张淑敏
导　师: 陈杰
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传与育种
关键词: 山羊 BLG shRNA 慢病毒 敲减
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


牛羊乳是人类最主要的乳资源,营养非常丰富,但和母乳相比,蛋白质组成上存在很大差异,尤其是乳中的BLG容易导致婴儿的消化不良,部分婴儿会产生过敏反应。消除乳汁中BLG过敏原是消除乳过敏症,提高乳品质量的重要手段。通过高温,高压,酶解法改变BLG的特性,消除婴幼儿对乳品的致敏性过程比较复杂,而且成本较高。鉴于慢病毒介导的RNAi技术在基因阻断方面取得的成绩,本研究的目的是构建靶向BLG慢病毒的RNAi载体,从细胞水平上检测BLG表达的变化,筛选出稳定表达的阳性细胞系,从而为高效转基因奶山羊新品种的培育奠定基础,更为生产易于婴儿消化吸收、低过敏性的乳品提供了一种具有良好的发展前景的方法。本研究首先构建靶向BLG基因不同靶位点的带U6启动子的shRNA质粒表达载体,和N1-BLG共转染山羊胎儿成纤维细胞,通过RT-PCR分析BLG基因的相对表达量,选择干扰BLG基因表达效果最好的干扰质粒.通过基因工程技术将该shRNA表达框架构建到慢病毒穿梭质粒载体plenti-Lacz上。然后应用慢病毒RNAi载体plenti-lacz-shRNA,转染包装细胞293T,收集病毒上清转染山羊胎儿成纤维细胞,经Blasticidin筛选并扩大培养得到稳定克隆；实时荧光定量PCR检测山羊胎儿成纤维细胞内BLG的表达。结果表明,通过基因重组技术成功构建了三个靶向山羊BLG的shRNA表达载体和慢病毒RNAi载体,其中之一能有效的降低BLG的表达,并且干扰率达到90%以上,差异显著(P<0.01)。提取重组质粒,生产病毒并感染山羊的成纤维细胞,4ug/ml的BLasticidin筛选液筛选10-12天获得稳定表达的阳性细胞系。经PCR鉴定并测序,shRNA已稳定的整合到山羊的成纤维细胞系中。经RT-PCR分析结果表明,阳性细胞系中BLG基因的表达量下降了90%以上,差异显著(P<0.01)。这表明,慢病毒载体有效的携带shRNA整合到山羊成纤维细胞中,并特异性的抑制BLG的表达。

全文目录


中文摘要  8-9英文摘要  9-11引言  11-12第一章 文献综述  12-24  1 BLG研究概况  12-14    1.1 β-乳球蛋白的分子结构  12    1.2 β-乳球蛋白的致敏性  12-13    1.3 消除BLG的致敏性的研究方法  13-14      1.3.1 高压酶解法消除BLG的致敏性  13      1.3.2 高温消除BLG的致敏性  13-14    1.4 其他方法  14  2 RNAi  14-20    2.1 RNAi的发现与发展  14-15    2.2 RNAi的分子机制  15-19      2.2.1 siRNA的设计  16-17      2.2.2 siRNA的制备  17-18      2.2.3 siRNA的转染  18-19    2.3 RNAi技术的特点  19-20    2.4 RNAi存在的若干问题及其前景展望  20  3 慢病毒介导的RNAi  20-22    3.1 慢病毒载体的组成成分  20-21    3.2 慢病毒介导的RNAi的特点  21-22    3.3 慢病毒载体安全性问题  22  4 本研究的目的意义  22-24第二章 靶向山羊BLG基因shRNA表达载体的构建及干涉效率的检测  24-44  1 实验材料  24-25    1.1 试验动物  24    1.2 菌株、质粒  24    1.3 网络资源及软件  24-25    1.4 主要试剂  25    1.5 仪器设备  25  2 实验方法  25-36    2.1 山羊胎儿皮肽成纤维细胞的培养  25-26      2.1.1 山羊胎儿皮肤成纤维细胞的原代培养  25-26      2.1.2 山羊胎儿皮肤成纤维细胞的传代培养  26      2.1.3 山羊胎儿皮肤成纤维细胞的冻存  26      2.1.4 山羊胎儿皮肤成纤维细胞的复苏  26    2.2 山羊BLG基因shRNA真核表达载体构建  26-27      2.2.1 靶向山羊BLG基因shRNA序列设计  26-27    2.3 BLG基因真核表达载体N1-BLG的构建  27-35      2.3.1 目的基因的获得  27-29      2.3.2 PCR扩增BLG基因的ORF,酶切回收  29-30      2.3.3 pEGFP-N1载体骨架的酶切回收  30-31      2.3.4 目的片段BLG和载体骨架pEGFP-N1的连接  31-32      2.3.5 转化  32      2.3.6 质粒的提取  32-33      2.3.7 PCR鉴定N1-BLG  33-34      2.3.8 酶切鉴定  34-35    2.4 RT-PCR定量分析shRNA表达载体对BLG干扰效率  35-36  3. 结果  36-42    3.1 PCR扩增BLG基因的ORF  36-37    3.2 pEGFP-N1载体骨架的酶切回收  37    3.3 PCR鉴定连接产物N1-BLG  37-39    3.4 酶切鉴定连接产物N1-BLG  39-40    3.5 real-time PCR定量分析结果  40-42  4 讨论  42-43  5 小结  43-44第三章 慢病毒RNAi载体的构建及靶向BLG基因的山羊转基因细胞系的建立  44-68  1 实验材料  44-45    1.1 菌株,质粒  44    1.2 主要试剂  44    1.3 仪器设备  44-45  2 实验方法  45-55    2.1 293FT细胞的培养  45-46      2.1.1 细胞解冻  45      2.1.2 细胞传代  45      2.1.3 细胞冻存  45-46    2.2 慢病毒RNAi载体的构建  46-51      2.2.1 慢病毒转运载体plenti-Lacz骨架的构建  46-47      2.2.2 shRNA表达框架的回收纯化  47-49      2.2.3 shRNA2表达框架和慢病毒载体plenti-Lacz骨架的连接  49-50      2.2.4 PCR鉴定plenti-Lacz-shRNA  50-51      2.2.5 酶切鉴定plenti-Lacz-shRNA  51    2.3 慢病毒包装质粒的扩增鉴定  51    2.4 病毒的生产  51-52    2.5 Blasticidin筛选慢病毒shRNA整合的细胞系  52-53      2.5.1 Blasticidin的浓度筛选方法  52      2.5.2 病毒感染山羊的胎儿成纤维细胞  52-53    2.6 PCR鉴定慢病毒shRNA整合的细胞系  53-54    2.7 定量分析山羊BLG的mRNA的相对表达量  54-55  3. 结果  55-66    3.1 慢病毒shRNA载体的构建  55-60      3.1.1 慢病毒转运载体plenti-Lacz骨架的构建  55-56      3.1.2 shRNA表达框架的回收纯化  56-57      3.1.3 PCR鉴定连接产物  57-60      3.1.4 酶切鉴定连接产物plenti-Lacz-shRNA2  60    3.2 病毒的生产  60-61      3.2.1 病毒包装质粒的扩增鉴定  60-61    3.3 Blasticidin最小致死量的确定  61-62    3.4 病毒感染山羊的胎儿成纤维细胞并筛选阳性细胞系  62-63    3.5 PCR鉴定慢病毒shRNA整合的细胞系  63-65    3.6 real-time PCR定量分析结果  65-66  4 讨论  66-67  5 小结  67-68论文总体结论  68-70参考文献  70-76致谢  76

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
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