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萝卜霜霉病抗性遗传标记与Rs-AFPs基因表达分析

作　者: 蒋秋玮
导　师: 龚义勤；柳李旺
学　校: 南京农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 萝卜 霜霉病抗性 分子标记 抗菌肽基因 表达特征
分类号: S631.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


萝卜(Raphanus sativus L.)是起源于中国的一种重要十字花科蔬菜作物,种质资源丰富,栽培历史悠久,具有较高的食用价值和经济价值。由寄生霜霉(Hyalonosporan parasitica)引起的霜霉病是十字花科作物上的一种世界性病害。近几年,萝卜霜霉病发生严重,尤其是春秋季保护地栽培温度适宜且潮湿的环境下更易发生,并且在整个生长期都容易发生,严重影响了萝卜的产量品质。因此,提高霜霉病抗性成为萝卜重要育种目标之一。目前十字花科蔬菜霜霉病的研究主要集中在芸薹属蔬菜作物上。萝卜霜霉病抗性的研究刚刚起步,本研究在研究室建立萝卜霜霉病抗性鉴定、抗性生理与遗传研究基础上,开展霜霉病抗性分子标记与Rs-AFPs基因表达分析,主要结果如下：以萝卜抗感材料NAU-dhp08×NAU-qtbjq-06组合的F2分离群体为试材,通过人工接种鉴定,采用混合分离分析法(BSA),采用高抗单株和高感单株分别构建抗感池,筛选了RAPD、EST-SSR、SRAP、ISSR和RGA引物。筛选了1866个引物或引物组合,通过F2单株验证,经x2测验后符合孟德尔遗传定律,遗传作图显示,与萝卜霜霉病抗性基因紧密连锁的标记中,遗传距离小于10cM的有3个,分别是Me7/em10400 (7.7 cM), NAUISSR862700 (5.9cM)与Em9/ga24370 (2.3 cM),最近的标记距抗性位点的距离为2.3cM,即Em9/ga24370。研究结果为萝卜霜霉病抗性标记辅助选择(Marker assisted selection, MAS),霜霉病抗性育种与新品种选育工作奠定了基础。根据萝卜中已报道的抗菌肽(Rs-AFPs)基因序列设计引物,以萝卜’NAU-dhp08’的叶片为试材,采用PCR法进行扩增,获得4种Rs-AFPs的基因组DNA,分别命名为Rs-AFP1、Rs-AFP2、Rs-AFP3和Rs-AFP4;获得的4条Rs-AFPs序列分别与芥菜Bj-AFP1基因(AB537492.1)(98%)、芥菜防御酶基因(DQ1 91751.1)(93%)、甘蓝防御酶基因(EF423802.1)(96%)和大白菜防御酶基因(AF528180.1)(97%)高度同源。采用RT-PCR法获得Rs-AFP3和Rs-AFP4的cDNA序列,其氨基酸分别与甘蓝,甘蓝型油菜同源性很高。半定量PCR分析表明,Rs-AFP3基因在接种霜霉病后6h表达量最高；Rs-AFP4基因在接种后有两次表达高峰,分别是在6h和36h时表达量最高。研究结果对于进一步揭示抗菌肽基因在萝卜抗霜霉病反应中的作用机制与生物学功能具有重要意义。

全文目录


目录  4-7摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略词表  11-12引言  12-13第一章 文献综述  13-23  1 蔬菜霜霉病抗性研究进展  13-18  2 萝卜抗菌肤Rs-AFPs研究进展  18-21  3 本研究的目的和意义  21-23第二章 萝卜霜霉病抗性基因分子标记分析  23-39  1 材料与方法  24-29    1.1 试验材料  24    1.2 试验方法  24-29      1.2.1 抗病鉴定  24-25        1.2.1.1 接种方法及病原菌的制备  24        1.2.1.2 病害鉴定  24-25      1.2.2 分子标记分析  25-28        1.2.2.1 总DNA的提取及检测  25        1.2.2.2 混合分离分析法(BSA)  25-26        1.2.2.3 RAPD标记分析  26        1.2.2.4 SRAP标记分析  26-27        1.2.2.5 EST-SSR标记分析  27        1.2.2.6 RGA分子标记  27-28          1.2.2.6.1 萝卜RGA标记体系优化  27          1.2.2.6.2 电泳结果分析  27-28        1.2.2.7 ISSR分子标记  28      1.2.3 引物筛选  28-29      1.2.4 连锁分析及图谱构建  29  2 结果与分析  29-37    2.1 苗期霜霉病抗性遗传分析  29    2.2 萝卜基因组总DNA的提取  29-30    2.3 分子标记分析  30-36      2.3.1 RAPD标记分析  30      2.3.2 SRAP标记分析  30-32      3.2.3 EST-SSR分析  32-33      2.3.4 RGA分析  33-35        2.3.4.1 RGA扩增条件的优化  33-35        2.3.4.2 RGA标记分析  35      2.3.5 ISSR 标记分析  35-36    2.4 与萝卜抗霜霉病基因连锁分析  36-37  3 讨论  37-39    3.1 霜霉病抗性遗传标记  37    3.2 分子标记的简便应用  37    3.3 BSA法的可靠性  37-39第三章 萝卜抗病相关基因Rs-AFPs的克隆与表达分析  39-51  1 材料与方法  39-44    1.1 试验材料  39    1.2 实验方法  39-44      1.2.1 基因组DNA的提取  40      1.2.2 病原菌收集及接种液制备  40      1.2.3 总RNA的提取  40      1.2.4 RNA纯化  40-41      1.2.5 RNA检测  41      1.2.6 RNA反转录  41      1.2.7 引物设计及特异性扩增  41-42        1.2.7.1 引物设计  42        1.2.7.2 萝卜抗菌肽Rs-AFPs基因DNA及cDNA特异扩增  42      1.2.8 Rs-AFPs基因克隆与分析  42-44        1.2.8.1 目的片段的回收  42        1.2.8.2 大肠杆菌感受态的制备  42-43        1.2.8.3 重组质粒的构建  43        1.2.8.4 重组质粒的转化  43        1.2.8.5 质粒的提取及重组质粒的鉴定  43-44        1.2.8.6 序列测定及分析  44      1.2.9 Rs-AFPs基因的表达分析  44  2 结果分析  44-50    2.1 Rs-AFPs基因的DNA及cDNA的克隆与分析  44-49      2.1.1 Rs-AFPs基因扩增  44-45      2.1.2 Rs-AFPs基因的DNA及cDNA克隆及序列分析  45-48      2.1.3 氨基酸序列同源性及进化树分析  48-49    2.2 Rs-AFP3与Rs-AFP4的表达分析  49-50      2.2.1 总RNA的提取与检测  49      2.2.2 Rs-AFP3与Rs-AFP4半定量表达分析  49-50  3 讨论  50-51    3.1 萝卜抗菌肽(Rs-AFPs)的同源性  50    3.2 抗菌肽在萝卜中的表达情况  50-51全文结论  51-53参考文献  53-59发表论文情况  59-61致谢  61

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 蔬菜园艺 > 根菜类（直根类） > 萝卜
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