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BKI1和BRI1互作最小区域的鉴定及功能探讨

作　者: 关钰
导　师: 王学路
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: 油菜素甾醇 BKI1 BRI1 酵母双杂交 信号转导
分类号: Q946
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究背景油菜素甾醇(Brassinosteroids, BRs)是一种广泛存在于植物中的类固醇激素,在植物的生长发育过程中起重要作用。经过十几年的研究,BR信号通路中的许多关键元件都已经被发现,BR信号通路也越来越清晰。植物通过位于细胞膜上的类受体蛋白激酶BRI1感知BR信号,当感受到BR信号后,BRI1的负调控蛋白BK11就会从细胞膜上解离,解除对BRI1的抑制,使BR信号向下游传递。现有的研究结果并没有对BRI1和其互作蛋白之间的调控机制作详细的报道,而作为BRI1的负调控子,BKI1与BRI1互作及调控机制也没有相关报道。研究目的探究BKI1是如何与BRI1结合从而发挥负调节作用的生化机制,并且从BKIl的结构预测出发对BKI1进行更深入的研究。材料与方法：材料：BKI1-RNAi, BKI1-YFP,△304-325-BKI1- YFP,304-325-BKI1- YFP转基因植物；各种截短的BKI1-pEXP-AD502酵母表达载体。方法：1.采用qRT-PCR的方法检测内源BKI1在转录水平的表达量；2.通过下胚轴伸长实验对BR信号的输出强弱进行定性分析；3.通过Blast、多序列比对、蛋白质二级结构预测等方法对BKIl进行生物信息学分析,从蛋白质结构上对BKI1进行初步研究；4.使用酵母双杂交实验寻找BKI1和BRI1互作的最小区域并检测该区域是否是唯一的且必须的互作区域；5.转基因烟草瞬时表达用于快速观察BKI1、A304-325-BKI1和304-325-BKI1的亚细胞定位,揭示304-325在维持BKI1构象中的作用。结果以BKI1-RNAi转基因植物为材料,从表型、内源BKI1的mRNA水平和下胚轴长度等方面证明了内源BKI1的减少可以增强BR信号的输出。之后的同源比对发现BKI1 C末端有两个氨基酸保守区域,并且在二级结构预测中发现其中的一个22个氨基酸的保守区域是C末端唯一的α螺旋结构。通过酵母双杂交实验证明该保守区域是BKI1和BRI1互作不可缺少的区域最后通过烟草定位发现这22个保守氨基酸缺失后BKI1的定位发生了改变,由原来的细胞膜和细胞质定位变成了细胞膜、细胞质和细胞核定位。从而确定了BKI1与BRI1互作的最小区域位于304-325,且初步推测该基序在维持BKI1构象中有一定贡献。结论304-325是BKI1 C末端的一段保守区域,同时也是一个α螺旋结构,该基序是BKI1和BRI1互作的最小区域,并且该基序对于维持BKI1的三维构象有一定的贡献。

全文目录


中文摘要  5-7
Abstract  7-9
第一章 引言  9-23
  1.1 油菜素甾醇及其信号通路概述  9-11
  1.2 油菜素甾醇在植物生长发育过程中的作用  11-15
    1.2.1 促进细胞伸长  11-12
    1.2.2 促进细胞分裂  12-13
    1.2.3 对根生长的调控作用  13-14
    1.2.4 促进种子萌发  14-15
    1.2.5 促进花粉管伸长并影响雄性育性  15
    1.2.6 胁迫响应  15
  1.3 油菜素甾醇信号通路上游组分综述  15-19
    1.3.1 膜受体BRI1  15-17
    1.3.2 正调控因子BAK1  17
    1.3.3 负调控因子BKI1  17-19
    1.3.4 正调控因子BSKs  19
  1.4 酵母双杂交  19-21
    1.4.1 酵母双杂交技术原理  20
    1.4.2 酵母双杂交流程  20-21
  1.5 烟草瞬时表达技术的应用  21-22
  1.6 研究内容及意义  22-23
第二章 材料与方法  23-37
  2.1 材料  23-24
    2.1.1 植物材料  23
    2.1.2 载体  23
    2.1.3 菌株  23
    2.1.4 试剂盒  23-24
    2.1.5 酶及其他  24
    2.1.6 仪器设备  24
    2.1.7 抗生素  24
    2.1.8 图像及数据分析软件  24
  2.2 方法  24-37
    2.2.1 载体构建  24-29
    2.2.2 大肠杆菌转化及质粒提取  29-31
    2.2.4 农杆菌电击转化  31
    2.2.5 拟南芥总RNA的提取  31-32
    2.2.6 cDNA第一链的合成  32-33
    2.2.7 RT-PCR扩增拟南芥所需基因cDNA  33
    2.2.8 植物培养及转化  33-35
    2.2.9 荧光实时定量PCR  35
    2.2.10 酵母双杂交  35-36
    2.2.11 烟草瞬时表达  36-37
第三章 结果  37-45
  3.1 内源BKI1的减少可以增强BR信号输出  37-38
  3.2 BKI1生物信息学分析  38-40
  3.3 酵母双杂交相关载体的构建  40-42
  3.4 BKI1 C末端的22氨基酸(304-325)基序是和BRI1互作的最小区域  42-44
  3.5 22氨基酸基序影响BKI1的亚细胞定位  44-45
第四章 讨论与展望  45-47
  4.1 讨论  45-46
  4.2 展望  46-47
第五章 附录  47-51
参考文献  51-55
在读期间发表的论文  55-56
作者简介  56-57
后记  57-59

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生物化学
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