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KiSS-1重组真核质粒的构建、表达及其与肝癌细胞增殖、粘附和侵袭关系的体外实验研究

作　者: 徐玫芳
导　师: 黄爱民
学　校: 福建医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: KiSS-1 MHCC97-H 体外 增殖 粘附 侵袭 肝细胞癌 重组真核载体
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的通过构建KiSS-1重组真核质粒并将其导入人高转移肝癌MHCC97-H细胞中,获得瞬时表达的细胞株,观察KiSS-1基因表达对肝癌细胞体外增殖、粘附及侵袭能力的影响,为进一步探讨其抗肝细胞癌侵袭转移的机制奠定基础。方法RT-PCR技术获得KiSS-1目的片段,基因克隆技术构建pcDNA3. 1/ HisC/ KiSS-1重组真核质粒。采用氯化钙共沉淀法将重组子转化至大肠杆菌Ecoli. Dh5α中进行扩增,PCR、双酶切、测序方法鉴定阳性重组质粒。脂质体转染方法,将基因导入具有高转移潜能的人肝癌细胞株MHCC97-H;RT-PCR和免疫细胞化学、Western-blot方法分别从mRNA和蛋白水平鉴定KiSS-1的表达。流式细胞术和MTT法检测KiSS-1表达对MHCC97-H细胞增殖能力的影响;基质(Matrigel和Fibronectin)粘附实验检测KiSS-1对MHCC97-H细胞粘附能力的影响;Transwell体外侵袭和趋化运动实验观察转染后细胞侵袭和运动能力的变化。结果1. PCR、双酶切及测序鉴定证实已将KiSS-1基因cDNA片段正确插入真核质粒中,成功构建了pcDNA3. 1/ HisC/ KiSS-1重组真核表达载体。2.脂质体介导的瞬时转染后,经RT-PCR、免疫细胞化学和Western-blot方法证实MHCC97-H细胞高效表达KiSS-1基因。3.细胞-Matrigel基质粘附实验和细胞-Fibronectin基质粘附实验显示,与空载体组MHC/pcDNA3. 1和未转染组细胞相比,转染组MHC/ KiSS-1细胞与Matrigel基质和Fibronectin基质的粘附能力均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。4.在Transwell侵袭实验中,转染组MHC/ KiSS-1细胞较空载体组MHC/pcDNA3. 1和未转染组细胞,其体外侵袭能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.01)。5.趋化运动实验结果显示,与空载体组MHC/pcDNA3. 1和未转染组细胞相比,转染组MHC/ KiSS-1细胞的体外运动能力显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。6.在流式细胞术测定细胞周期实验中,转染组MHC/ KiSS-1细胞较空载体组MHC/pcDNA3. 1和未转染组细胞,未出现明显的周期阻滞。7. MTT体外增殖实验中,转染组MHC/ KiSS-1细胞的增殖能力与空载体组MHC/pcDNA3. 1和未转染组细胞相比略有下降,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.成功获得pcDNA3. 1/ HisC/ KiSS-1重组真核质粒和瞬时表达KiSS-1基因的肝癌细胞,为后续体外实验研究KiSS-1对人肝癌细胞增殖、粘附和侵袭能力的影响奠定基础。2.体外实验表明KiSS-1表达可抑制肝癌细胞与Matrigel基质及Fibronectin基质的粘附能力、体外侵袭能力和运动能力。3. MTT增殖实验和FCM细胞周期分析提示KiSS-1表达不影响肝癌细胞的体外增殖能力。4. KiSS-1表达可抑制肝癌细胞的粘附、侵袭和运动能力,提示其可作为一个候选的肝细胞癌转移抑制基因可望成为肝癌侵袭转移治疗的新靶点。

全文目录


英、汉缩略名词对照表  4-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-12
材料与方法  12-28
结果  28-39
讨论  39-44
结论  44-45
参考文献  45-48
致谢  48-49
综述  49-58

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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