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低分子量亨氏马尾藻岩藻聚糖硫酸酯的制备及抗肿瘤活性研究

作　者: 李春莲
导　师: 王维民
学　校: 广东海洋大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 亨氏马尾藻 分级纯化 降解粗酶 低分子量岩藻聚糖 酶降解 体外培养 抗肿瘤
分类号: TS254.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


亨氏马尾藻（Sargassum henslowianum C.Agardh）隶属褐藻门,墨角藻目,马尾藻科,马尾藻属。岩藻聚糖硫酸酯（Fuciodan）是海藻多糖中一类独特的结合有硫酸基团的活性多糖,具有显著的抗病毒、抗肿瘤、抗菌、抗凝血及提高机体免疫力等作用。但由于其分子量大,溶解性较差,不容易被人体吸收,所以在研究和应用方面受到了限制。酶降解是一种温和的制备低分子量的活性海藻多糖的方法,但是市售的酶制剂价格昂贵,降解效果不佳,因此寻找更经济实惠的酶制剂值得进一步的研究。本文以广东湛江硇洲岛的亨氏马尾藻为原料,对已初步分离纯化的亨氏马尾藻岩藻聚糖（SF）再进行分离纯化,并以新鲜的海洋小杂鱼内脏为原料来提取降解海藻多糖粗酶,再以酶法降解大分子量的亨氏马尾藻岩藻聚糖,并对降解前后亨氏马尾藻岩藻聚糖的抗肿瘤活性与分子量、理化组成的关系展开了研究。本文首先以八种新鲜海洋小杂鱼的肝胰脏为原料,比较得出从沙钻鱼肝胰脏提取出活力较高的酶。以磷酸盐缓冲液为浸提液,在单因素的基础上通过L9（34）正交试验对浸提工艺条件进行优化,试验结果得出最佳的浸提条件为:浸提pH6.0、浸提温度35℃、浸提时间3 h。再对粗酶液进行分步盐析沉淀,先以饱和度30%的硫酸铵除去部分杂质,离心收集上清液进行硫酸铵盐析沉淀。在单因素的基础上采用L9（34）正交试验对盐析工艺条件硫酸铵饱和度、pH、温度、时间进行优化,得出最佳的盐析条件为:硫酸饱和度为80%、盐析pH为5.5、盐析温度为45℃、盐析时间为3 h。将制备的酶进行SephadexG-100柱层析,洗脱出D1、D2、D3三个蛋白组分,其中组分D2的酶活力最大,D1、D3几乎没有酶活力,收集组分D2冷冻干燥,低温保存。通过凝胶过滤法（Gel Filtration, GF）对超声波热水提取并用纤维素阴离子交换树脂（Cellulose DE-52 ）分离纯化得到的亨氏马尾藻岩藻聚糖再进行分级纯化,通过SepharoseCL-6B琼脂凝胶柱柱层析得到4个组分:SF1、SF2、SF3、SF4,经鉴定均为分子量较均一的组分。凝胶过滤标准曲线法测定4个组分的相对分子量分别为:851.13kDa,239.85kDa,102.34kDa,19.95kDa。采用酶法对4个组分进行降解得到相应的降解组分:SF1-R、SF2-R、SF3-R、SF4-R,通过L9（34）正交试验得出最优酶降解条件组合为:底物浓度为0.6%、降解pH为5.0、降解温度为45℃、降解时间为4 h。同样采用凝胶过滤标准曲线法测得降解后的4个组分的相对分子量分别为:53.74kDa,19.54kDa,9.27kDa,6.69kDa,对比降解前后的各多糖组分的相对分子量得出SF1、SF2、SF3、SF4降解倍数分别为:15.82,12.34,11.22,3.01。通过标准曲线法对降解前后多糖组分进行理化分析:得出SF1、SF1-R、SF2、SF2-R、SF3、SF3-R、SF4、SF4-R的总糖含量分别为:72.92%,70.15%,67.55%,65.46%,60.87%,59.23%,56.81%,55.78%;L-岩藻糖含量分别为:38.82%,36.91%,34.12%,31.33%,30.19%,25.58%,26.86%,19.84%;糖醛酸含量分别为:4.14%,4.65%,6.37%,7.43%,8.35%,8.93%,9.72%,10.23%;硫酸基含量分别为:30.93%,33.63%,32.65%,35.87%,29.88%,30.44%,21.61%,20.85%。通过细胞体外培养法,采用MTT比色法研究了八组分亨氏马尾藻岩藻聚糖在5个质量浓度（1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL）下分别对小鼠肉瘤细胞S-180、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞SMMC-7721作用24 h、48 h、72 h时细胞增殖的抑制情况,结果分析表明:不同浓度,不同时间,八组分亨氏马尾藻岩藻聚糖对三种肿瘤细胞的抑制作用不同,随着亨氏马尾藻岩藻聚糖质量浓度的增加和作用时间延长,3种肿瘤细胞的抑制作用分别呈现不断增强趋势,呈现一定的剂量和时间的依赖效应。采用统计学分析了八组分亨氏马尾藻岩藻聚糖对三种肿瘤细胞的抑制效果（P<0.05显著,P<0.01极显著）,结果表明:在48 h72 h组, SF1-R、SF2-R对三种肿瘤细胞增殖的抑制效果较各自降解前SF1、SF2的抑制效果有显著性提高（P<0.05显著,P<0.01极显著）;在72 h组,降解后的SF3-R抑制效果较显著于降解前的抑制效果（P<0.05显著,P<0.01极显著）;在24 h72 h组,降解后的SF4-R较降解前的抑制效果显著性不明显（P>0.05）。结果分析还表明,8组分多糖中SF2-R对S-180、A549细胞增殖的抑制效果显著于其他组分,SF2-R对S-180、A549细胞作用72 h后的抑制率分别为:77.57%,61.06%;8组分多糖中SF1-R对SMMC-7721细胞增殖的抑制效果显著于其余组分,作用72 h后抑制率达到62.47%。经计算:SF1、SF1-R、SF2、SF2-R、SF3、SF3-R、SF4、SF4-R对S-180作用72 h的IC50值分别为:7.11mg/mL、5.57mg/mL、6.61mg/mL、4.89mg/mL、9.91mg/mL、8.91mg/mL、14.66mg/mL、14.79mg/mL;对A549作用72 h的IC50值分别为:11.64mg/mL、9.86mg/mL、10.63 mg/mL、8.75mg/mL、14.37mg/mL、12.62mg/mL、18.71mg/mL、20.27mg/mL;对SMMC-7721作用72 h的IC50值分别为:9.33mg/mL、7.88mg/mL、11.48mg/mL、9.75mg/mL、13.66mg/mL、12.84mg/mL、15.94mg/mL、16.83mg/mL。

全文目录


摘要  6-8Abstract  8-151 绪论  15-26  1.1 引言  15-16  1.2 海藻多糖的研究现状  16-19    1.2.1 海藻多糖的提取纯化  16-18    1.2.2 海藻多糖的活性研究  18    1.2.3 海藻多糖结构分析  18    1.2.4 海藻多糖分子量的测定方法研究  18-19  1.3 低分子量岩藻聚糖的制备  19-21    1.3.1 物理降解法  20    1.3.2 化学降解法  20    1.3.3 生物降解法  20-21  1.4 海藻岩藻聚糖降解酶的研究现状  21-22    1.4.1 海藻多糖降解酶的原料来源  21-22    1.4.2 海藻多糖降解酶的性质  22  1.5 岩藻聚糖的抗肿瘤活性  22-24    1.5.1 抗肿瘤机制  23-24  1.6 本课题的立题背景和研究意义  24-25  1.7 研究内容及研究目标  25-262 沙钻鱼内脏中降解马尾藻岩藻聚糖粗酶的提取研究  26-41  2.1 引言  26  2.2 实验材料  26-27    2.2.1 主要试剂  26-27    2.2.2 主要仪器  27  2.3 实验方法  27-30    2.3.1 蛋白酶活力的测定  27-28    2.3.2 水溶性蛋白含量的测定  28    2.3.3 原料的选择  28    2.3.4 粗酶液的制备  28-29    2.3.5 硫酸铵分级沉淀  29-30    2.3.6 SephadexG-100 凝胶柱层析  30  2.4 结果与分析  30-40    2.4.1 酶活力测定的标准曲线的制备  30-31    2.4.2 可溶性蛋白质测定标准曲线的制备  31    2.4.3 原料的确定  31    2.4.4 粗酶液制备条件的确定  31-35    2.4.5 降解粗酶盐析条件的确定  35-39    2.4.6 SephadexG-100 凝胶柱层析分析  39    2.4.7 讨论  39-40  2.5 本章小结  40-413 亨氏马尾藻岩藻聚糖酶降解及分子量的测定  41-64  3.1 引言  41-42  3.2 实验材料  42-43    3.2.1 主要试剂  42    3.2.2 主要仪器  42-43  3.3 实验方法  43-47    3.3.1 琼脂凝胶柱层析分离纯化马尾藻多糖  43    3.3.2 亨氏马尾藻岩藻聚糖纯度的鉴定  43    3.3.3 亨氏马尾藻岩藻聚糖降解条件的确定  43-44    3.3.4 亨氏马尾藻岩藻聚糖理化组分的分析及分子量的测定  44-47    3.3.5 红外光谱分析  47  3.4 结果与分析  47-63    3.4.1 琼脂糖凝胶柱层析分离纯化亨氏马尾藻多糖  47-48    3.4.2 琼脂凝胶柱层析鉴定各多糖组分纯度  48    3.4.3 亨氏马尾藻岩藻聚糖酶降解条件的研究  48-53    3.4.4 理化组分的测定结果  53-55    3.4.5 凝胶过滤法测定各多糖组分及其降解产物的相对分子量分布  55-57    3.4.6 红外图谱及分析  57-62    3.4.7 讨论  62-63  3.5 本章小结  63-644 亨氏马尾藻岩藻聚糖体外抗肿瘤活性的研究  64-87  4.1 引言  64-65  4.2 实验材料  65-67    4.2.1 细胞株  65    4.2.2 药物  65    4.2.3 主要试剂  65    4.2.4 主要仪器  65-66    4.2.5 主要试剂配制  66-67  4.3 实验方法  67-70    4.3.1 肿瘤细胞的培养  67    4.3.2 肿瘤细胞的复苏、传代、冻存  67-68    4.3.3 细胞的计数  68    4.3.4 亨氏马尾藻岩藻聚糖对三种肿瘤细胞增殖的影响  68-69    4.3.5 三种肿瘤细胞铺板数量的确定  69-70    4.3.6 倒置显微镜观察细胞形态  70    4.3.7 统计与分析方法  70  4.4 结果与分析  70-85    4.4.1 MTT 比色法测定三种肿瘤细胞铺板数量  70-72    4.4.2 亨氏马尾藻岩藻聚糖对肿瘤细胞抑制作用的浓度确定  72-73    4.4.3 贴壁细胞消化过程  73-74    4.4.4 亨氏马尾藻岩藻聚糖作用于三种肿瘤细胞的形态观察  74-76    4.4.5 亨氏马尾藻岩藻聚糖对三种肿瘤细胞增殖的影响情况及IC_(50) 值  76-84    4.4.6 讨论  84-85  4.5 本章小结  85-875 总结论和展望  87-89参考文献  89-96致谢  96-97作者简历  97导师简介  97

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 水产加工工业 > 水产副产品加工及利用
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