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两个杨树无性系再生体系的建立及抗虫基因Cry1C+9C转化的初步研究

作　者: 卢小三
导　师: 涂炳坤；张卓文；王鹏程
学　校: 华中农业大学
专　业: 森林培育
关键词: 杨树无性系再生体系农杆菌抗虫基因Cry1C+9C 遗传转化
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

杨树作为三大速生树种之一,在湖北省林业产业中具有重要的地位。杨树无性系LH05-143、SN04-31和LN05-51作为F1代杂交无性系,在湖北省石首市杨树研究所试验林中生长表现良好,具有一定超亲优势,并已经进入品种鉴定阶段。本论文以杨树无性系LH05-143和SN04-31叶柄为外植体,建立了2个无性系的再生体系,并以杨树无性系LN05-51为受体材料,开展了农杆菌介导下的抗虫基因Cry1C+9C转化初步研究,获得了主要研究结果如下：1.以无性系LH05-143为研究对象,得出再生体系的最佳外植体为叶柄。叶柄的最佳消毒方法为：75%酒精消毒30s后灭菌水清洗2-3次,再用0.1%HgCl2消毒5min,LH05-143的污染率为10%,褐化率为5%。2.在诱导愈伤组织的研究中,叶柄的放置方式对愈伤诱导率影响不显著,但诱导愈伤数存在显著差异,并最终确定杨树无性系再生材料叶柄的放置方式以横放最佳。3.间接再生诱导中,LH05-143和SN04-31的最佳愈伤诱导培养基配方均为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 1.0mg/L,此时获得的愈伤组织紧实,颜色浅绿；在获得愈伤组织的分化试验中,发现LH05-143的最佳分化培养基配方为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.1mg/L,而SN04-31则为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L。4.直接再生过程中,本文利用二次回归正交试验设计优化了LH05-143不定芽分化试验中激素6-BA(x1)和NAA(x2)的浓度及配比,获得了二次回归方程y=2.5699+0.4101x1-0.2694x2+0.0093x1x2-0.9183x12-0.2537x22并通过方程得到了关于LH05-143不定芽分化的最佳激素浓度为6-BA1.75mg/L、NAA 0.30mg/L；对SN04-31的不定芽诱导采用了双因素试验,得到其最佳分化培养基配方为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L。5.所得不定芽的继代增殖试验中,LH05-143的最佳培养基配方为MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.05mg/L,SN04-31的最佳培养基配方为MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+6-BA 0.1mg/L+NAA 0.02mg/L。6.LH05-143的最佳生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.5mg/L,SN04-31的最佳生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.2mg/L。7.进行了杨树无性系LN05-51叶片不定芽分化和无菌苗生根的卡那霉素敏感性试验,确定了叶片分化的临界浓度为20mg/L,生根的临界浓度为15 mg/L。8.对转化过程中农杆菌的抑制试验发现最佳的抑菌措施是在筛选培养基中添加头孢霉素400mg/L,另在培养基表层覆盖一层灭菌滤纸,并需要及时更换培养基。9.采用叶盘法,对无性系LN05-51进行了抗虫基因Cry1C+9C的转化,发现在共培培养基中添加乙酰丁香酮对抗性苗的获得不存在显著影响。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-12
前言  12
1 文献综述  12-26
  1.1 杨树组织培养研究进展  12-20
    1.1.1 愈伤组织培养  13-14
    1.1.2 植物器官培养  14-15
    1.1.3 胚胎培养  15-16
    1.1.4 原生质体培养和体细胞杂交  16
    1.1.5 花药与花粉培养  16-17
    1.1.6 杨树组织培养的影响因素  17-20
      1.1.6.1 外植体的选择  17-18
      1.1.6.2 培养基及植物生长调节物  18-19
      1.1.6.3 组织培养其它影响因素  19-20
  1.2 杨树抗虫基因遗传转化研究进展  20-26
    1.2.1 杨树遗传转化技术  20-22
      1.2.1.1 农杆菌介导法  20-21
      1.2.1.2 基因枪法  21-22
      1.2.1.3 其它方法  22
    1.2.2 杨树抗虫基因  22-26
      1.2.2.1 Bt毒蛋白基因  23-24
      1.2.2.2 蛋白酶抑制剂基因(PI)  24-25
      1.2.2.3 其它抗虫基因  25-26
2 课题研究的目的与意义  26-28
3 杨树无性系LH05-143和SN04-31再生体系的建立  28-48
  3.1 试验材料与方法  28-33
    3.1.1 试验材料  28
      3.1.1.1 外植体材料  28
      3.1.1.2 试验仪器  28
      3.1.1.3 试验试剂与配置方法  28
    3.1.2 试验方法  28-33
      3.1.2.1 外植体消毒  29
      3.1.2.2 间接诱导再生  29-30
      3.1.2.3 直接诱导再生  30-32
      3.1.2.4 再生不定芽的继代增殖  32
      3.1.2.5 生根试验  32-33
  3.2 试验统计指标  33
  3.3 试验统计方法及使用的软件  33-34
  3.4 实验结果与分析  34-48
    3.4.1 外植体的消毒  34-35
    3.4.2 间接诱导再生  35-41
      3.4.2.1 外植体不同放置方式对愈伤诱导的影响  35-36
      3.4.2.2 愈伤组织诱导  36-39
      3.4.2.3 愈伤组织分化  39-41
    3.4.3 直接诱导再生  41-45
      3.4.3.1 杨树无性系LH05-143的直接再生不定芽  41-43
      3.4.3.2 杨树无性系SN04-31的直接再生不定芽  43-45
    3.4.4 继代增殖  45-46
    3.4.5 生根培养  46-48
4 抗虫基因CRY1C+9C转化的初步研究  48-55
  4.1 试验材料与方法  48-51
    4.1.1 试验材料  48-49
      4.1.1.1 植物材料  48
      4.1.1.2 农杆菌类型及基因材料  48-49
      4.1.1.3 试验仪器  49
      4.1.1.4 相关试验试剂配置  49
    4.1.2 试验方法  49-51
      4.1.2.1 菌株的活化与保存  50
      4.1.2.2 卡那霉素(Kan)浓度筛选  50-51
      4.1.2.3 头孢霉素(Cef)浓度筛选  51
      4.1.2.4 乙酰丁香酮(AS)对杨树无性系LN05-51基因转化的影响  51
  4.2 试验统计指标  51
  4.3 试验统计方法  51-52
  4.4 试验结果与分析  52-55
    4.4.1 卡那霉素(Kan)浓度的筛选  52-53
    4.4.2 头孢霉素(Cef)浓度的筛选  53-54
    4.4.3 乙酰丁香酮(AS)对杨树无性系LN05-51抗虫基因转化的影响  54-55
5 讨论  55-63
  5.1 杨树无性系再生体系的建立  55-59
    5.1.1 外植体的选择与处理  55-57
      5.1.1.1 外植体类型的选择  55
      5.1.1.2 外植体的污染  55-56
      5.1.1.3 外植体的褐化  56-57
    5.1.2 植物激素在再生体系中的运用  57-58
    5.1.3 培养基配方对不定芽增殖的影响  58-59
    5.1.4 二次回归正交试验设计在杨树不定芽诱导中的运用  59
  5.2 杨树无性系LN05-51抗虫基因CRY1C+9C转化的初步研究  59-61
    5.2.1 Kan筛选临界浓度的确定  59-60
    5.2.2 头孢霉素(Cef)抑菌浓度的确定  60-61
    5.2.3 AS对杨树抗虫基因遗传转化的影响  61
  5.3 论文研究中的不足  61-62
    5.3.1 杨树无性系再生体系  61-62
    5.3.2 抗虫基因Cry1C+9C的遗传转化试验  62
  5.4 展望  62-63
参考文献  63-71
附图  71-74
致谢  74

两个杨树无性系再生体系的建立及抗虫基因Cry1C+9C转化的初步研究

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