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蓝耳病病毒克隆测序、单克隆抗体制备及唾液酸粘附素的克隆表达

作　者: 邱洪凯
导　师: 周恩民
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PRRSV 间接免疫荧光 单克隆抗体 唾液酸粘附素
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的接触性传染病。该病主要引起妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍以及各年龄段猪的呼吸道症状和高死亡率。该病于1987年首先发现于美国,随后波及多个国家和地区。我国1991年在台湾发现该病,郭宝清在1996年首次从流产胎儿中分离到PRRSV,证实了PRRSV在我国的存在(郭宝清,1996)。2006年下半年的“无名高热”疫情在我国南方大面积暴发,最后确诊为高致病性PRRS。该病造成较高的发病率和死亡率,而且临床症状逐渐复杂,流行范围逐渐扩大。目前PRRS已经遍及全球主要养猪的国家和地区,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。本课题共分为三部分:1 PRRSV变异毒株SD-TA株的分离鉴定及序列分析2008年从猪“高热病”病料中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(SD-TA株),该病毒能够被抗PRRSV阳性猪血清所识别。根据GenBank PRRSV经典株(VR-2332)和变异株(JXA1)基因序列分别设计合成了10对引物,利用RT-PCR扩增其基因序列,分别得到了预期的基因片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序。应用DNASTAR软件分析,与国内外已发表毒株的序列进行比较。结果显示,与美洲型相比,PRRSV SD-TA株相应基因核苷酸同源性为89.3%～99.1%,并且在Nsp2上缺失了30个氨基酸;与欧洲型代表毒株LV株相比同源性为59.9%。遗传关系表明:SD-TA株属于高致病性变异株。2猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达、纯化与单克隆抗体的制备将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株的N蛋白基因的重组质粒pET-30 a(+)-ORF7经鉴定后转化入Rosetta感受态细胞并进行诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白大小约为21KD。将纯化的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,以表达的融合蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法对融合细胞上清进行抗体检测,并通过有限稀释法,获得了1株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为6D10。经Western-blot检测,所获得的单克隆抗体6D10能与N蛋白发生特异性反应,并经间接免疫荧光检测结果表明,所获得的单克隆抗体6D10能与PRRSV经典株(VR、BJ和疫苗株MLV)和高致病性变异株(SD-TA、2#和4#株)产生特异性反应。3唾液酸粘附素的克隆测序、表达以及蛋白纯化根据GenBank NM-214346基因序列分别设计了5对引物,从PAM细胞中利用RT-PCR扩增唾液酸粘附素基因序列,结果分别得到了预期的基因片段,其大小分别为:1125bp、1062bp、1101bp、1182bp和1200bp。将扩增的cDNA片段克隆pMD18-T载体并测序。将构建的重组质粒pET-28a-Sn-1~5经限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定后转化入Rosetta感受态细胞并进行诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白大小分别约为41.4KD、36.7KD、38.5KD、42.3KD和42.9KD,与预期结果相吻合。经Western-blot检测,所获得的各段重组蛋白均能与抗His-单克隆抗体发生特异性反应。

全文目录


中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
1 引言  13-28
  1.1 PRRSV生物学特征  14-15
  1.2 PRRSV基因组结构  15-19
    1.2.1 非结构蛋白  16
    1.2.2 结构蛋白  16-19
  1.3 PRRSV遗传变异  19-21
    1.3.1 结构蛋白编码区的变异  20-21
    1.3.2 非结构蛋白编码区的变异  21
  1.4 PRRSV免疫学与致病机制的研究进展  21-24
    1.4.1 体液免疫反应  21-22
    1.4.2 细胞免疫反应  22-23
    1.4.3 PRRSV的致病机制  23-24
  1.5 单克隆技术  24-26
    1.5.1 单克隆抗体技术的基本原理  24
    1.5.2 单克隆抗体的特点  24-25
    1.5.3 单克隆抗体的应用  25
    1.5.4 单克隆抗体的未来前景  25-26
  1.6 PRRSV受体的研究进展  26-27
  1.7 PRRSV的预防及控制  27-28
  1.8 研究的目的和意义  28
2 材料与方法  28-52
  2.1 材料  28-33
    2.1.1 病料、细胞及PRRSV毒株  28-29
    2.1.2 试验动物  29
    2.1.3 实验试剂及耗材  29
    2.1.4 质粒及受体菌  29-31
    2.1.5 主要试剂配制  31-33
    2.1.6 主要设备及仪器  33
  2.2 方法  33-52
    2.2.1 病料的处理  33
    2.2.2 盲传病毒  33
    2.2.3 病毒的大量繁殖  33
    2.2.4 病毒的TCID50的测定  33-34
    2.2.5 间接免疫荧光试验（IFA）  34
    2.2.6 病毒RNA的提取  34-35
    2.2.7 猪肺巨噬细胞（PAM）的制备  35
    2.2.8 细胞的培养及传代  35-36
    2.2.9 引物设计及合成  36-37
    2.2.10 RT-PCR检测  37-38
    2.2.11 氯化钙法制备新鲜的E.coli 感受态细胞  38-39
    2.2.12 PCR产物回收及连接  39
    2.2.13 重组质粒转化DH5α感受态细胞  39
    2.2.14 重组质粒的提取  39-40
    2.2.15 重组质粒的PCR鉴定  40
    2.2.16 重组质粒的序列分析鉴定  40-41
    2.2.17 表达重组质粒的构建及鉴定  41-42
    2.2.18 重组质粒的诱导表达  42-43
    2.2.19 SDS-PADE 蛋白质电泳分析  43-44
    2.2.20 诱导表达条件的筛选机优化  44-45
    2.2.21 重组蛋白的大量表达  45
    2.2.22 重组蛋白的纯化  45-47
    2.2.23 免疫Balb/c小鼠  47
    2.2.24 间接ELISA 检测方法的建立及判定标准  47
    2.2.25 间接ELISA 检测小鼠免疫后的抗体水平  47-48
    2.2.26 单克隆抗体的制备  48-51
    2.2.27 Western blot 分析  51-52
3 结果与分析  52-62
  3.1 病毒分离结果  52
  3.2 SD-TA 株TCID50的检测结果  52-53
  3.3 间接免疫荧光试验结果  53-54
    3.3.1 分离毒株SD-TA的IFA结果  53
    3.3.2 单克隆抗体6D10 IFA结果  53-54
  3.4 PCR检测结果  54-56
    3.4.1 SD-TA毒株的PCR检测结果  54-55
    3.4.2 唾液酸粘附素的PCR扩增结果  55-56
  3.5 重组质粒鉴定结果  56-57
    3.5.1 重组质粒pET-30a (+)-ORF7 的鉴定结果  56
    3.5.2 重组质粒pET-28a-Sn-1~5的鉴定结果  56-57
  3.6 序列分析结果  57-58
    3.6.1 全基因组序列分析结果  57-58
    3.6.2 非结构蛋白Nsp2 序列分析  58
    3.6.3 主要结构蛋白基因序列分析  58
  3.7 重组质粒的表达及纯化  58-60
    3.7.1 重组质粒pET-30a (+)-ORF7 的表达及纯化  58-59
    3.7.2 重组质粒pET-28a (+)-Sn-1~5的表达及纯化  59-60
  3.8 间接ELISA方法检测小鼠抗体水平及其效价  60-61
  3.9 杂交瘤细胞株的获得  61
  3.10 Western blot 结果  61-62
    3.10.1 单克隆抗体6D10 Western blot 结果  61-62
    3.10.2 重组蛋白Sn-1~5 Western blot 结果  62
4 讨论  62-66
  4.1 PRRSV SD-TA 株的分离及克隆测序  62-64
  4.2 PRRSV N蛋白的表达纯化及单克隆抗体的制备  64-65
  4.3 唾液酸粘附素的克隆测序、表达及蛋白纯化  65-66
5 结论  66-67
参考文献  67-76
致谢  76-77
附录:硕士在读期间发表的论文情况  77

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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