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组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A对猪卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

作　者: 陈侠
导　师: 徐银学
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 组蛋白去乙酰化酶抑制剂 曲古抑菌素A MTT法 间接免疫荧光 流式细胞仪 荧光定量RT-PCR 细胞凋亡 细胞周期
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


颗粒细胞是卵巢中十分重要的体细胞,其在发育的不同阶段合成和分泌激素以及多种生长因子,并通过自分泌或旁分泌途径发挥作用。颗粒细胞对卵母细胞成熟、卵泡发育有至关重要的作用。颗粒细胞的凋亡是导致卵泡闭锁的很重要的原因。如果一个发育卵泡中10%以上的颗粒细胞发生凋亡,则表明该卵泡已经或正在闭锁。曲古抑菌素A是一种重要的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,近年来研究发现,其对多种肿瘤细胞具有抑制作用,作用机理包括诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞细胞周期和促进细胞分化等。组蛋白去乙酰化酶抑制剂作为一种非常有前景的抗肿瘤药物,其对机体正常细胞的作用尚待研究。因此,本试验以TSA为代表药物,研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂对猪卵巢颗粒细胞的作用,并就其机理作初步探讨,以为临床用药提供一定的参考。具体研究内容如下。采用MTT法测定组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对猪卵巢颗粒细胞活性的影响。结果显示：TSA在低浓度时(10ng/mL以下)对猪卵巢颗粒细胞的生长没有影响,但随着药物浓度的增加,猪卵巢颗粒细胞的生长受到抑制(P<0.05),且这种抑制作用具有剂量依赖性。在10ng/mL和200ng/mL时,随着处理时间的延长,在48h时略有升高,而在72h时又降低,但各时间点测定的OD550值差异不显著(P>0.05),表明TSA对猪卵巢颗粒细胞生长抑制不具有时间依赖性。利用间接免疫荧光研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对正常猪卵巢颗粒细胞乙酰化水平的影响,并利用荧光定量PCR技术从分子水平对机制做进一步研究。间接免疫荧光结果显示,200 ng/mL TSA处理的颗粒细胞与对照组比较组蛋白H3乙酰化水平变化显著,而在低浓度下(10 ng/mL)变化不显著。荧光定量PCR结果显示,200ng/mL TSA处理24 h, Hadc-1、Hadc-3和p300 mRNA表达与空白对照组比较差异显著(P<0.05),在低浓度(10 ng/mL)时,差异不显著(P>0.05)。表明TSA在较高浓度下影响正常颗粒细胞的乙酰化水平,而在低浓度下对颗粒细胞乙酰化水平不产生影响。采用流式细胞仪检测不同浓度曲古抑菌素A (TSA)作用于颗粒细胞24h后,颗粒细胞凋亡率的变化,以确定凋亡是否为TSA作用后颗粒细胞生长抑制的机制。结果显示：200ng/m TSA处理组的细胞凋亡率为13.7%,高于空白对照组9.1%,差异显著(P<0.05); 10ng/mL处理组与空白对照相比,凋亡率无明显差异(P>0.05),表明高浓度TSA促进颗粒细胞活性凋亡,细胞凋亡是颗粒细胞活性的影响方式之一。采用流式细胞仪检测不同浓度曲古抑菌素A (TSA)作用于颗粒细胞24h后,颗粒细胞周期的变化情况,并利用荧光定量RT-PCR技术从分子水平对细胞周期相关基因进行研究。流式细胞术结果显示：与空白对照组相比,200 ng/mL TSA处理24 h后,G0/G1期细胞百分比有明显的上升(P<0.05),S期细胞百分比显著降低(P<0.05),G2/M期细胞百分比差异不显著。而低浓度(10 ng/mL)处理各期细胞百分比无明显变化。同样,荧光定量PCR结果显示,与空白对照组比较,200 ng/mL TSA处理24 h,Cyclin D2和CDK4 mRNA有明显变化,差异显著(P<0.05),而在低浓度下(10ng/mL), Cyclin D2和CDK4 mRNA的表达差异不显著(P>0.05)。表明颗粒细胞用200 ng/mL TSA处理后,细胞周期被阻滞在G0/G1期,Cyclin D2和CDK4基因表达的显著降低可能是周期阻滞的重要原因。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11缩略词  11-12引言  12-13第一章 文献综述  13-27  1 卵泡发育与颗粒细胞  13-16    1.1 卵泡发育过程  13-14    1.2 颗粒细胞在卵泡发育过程中的作用  14-15    1.3 卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡  15-16  2 组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂研究进展  16-19    2.1 组蛋白及其乙酰化  16-17    2.2 组蛋白去乙酰化酶  17-18    2.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂及其作用  18-19  3 本研究的目的和意义  19-21  参考文献  21-27试验研究  27-65  试验一 曲古抑菌素A对猪卵巢颗粒细胞活性的影响  27-37    1 材料与方法  28-31      1.1 材料  28-29      1.2 方法  29-31    2 结果与分析  31-32    3 讨论  32-34    参考文献  34-37  试验二 曲古抑菌素A对猪卵巢颗粒细胞乙酰化水平的影响  37-51    1 材料与方法  37-42      1.1 材料  37-38      1.2 方法  38-42    2 结果与分析  42-47      2.1 间接免疫荧光检测曲古抑菌素A对组蛋白乙酰化水平的影响  42-46      2.2 曲古抑菌素A对Hadc-1、Hadc-3和P300基因表达的影响  46-47    3 讨论  47-50    参考文献  50-51  试验三 曲古抑菌素A对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响  51-57    1 材料与方法  51-53      1.1 材料  51-52      1.2 方法  52-53    2 结果与分析  53-54    3 讨论  54-56    参考文献  56-57  试验四 曲古抑菌素A对猪卵巢颗粒细胞周期的影响  57-65    1 材料与方法  58-61      1.1 材料  58-59      1.2 方法  59-61    2 结果与分析  61-62      2.1 流式细胞术检测TSA对卵巢颗粒细胞周期的影响  61-62      2.2 TSA处理对细胞周期相关基因表达的影响  62    3 讨论  62-64    参考文献  64-65全文结论  65-67附录  67-69致谢  69

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 猪
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