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猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体CD163、Sn的克隆及功能鉴定

作　者: 鲍登克
导　师: 张改平
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 病毒受体 CD163 唾液酸粘附素
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合症(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS )的病原体。PRRSV主要引起母猪的流产和仔猪的呼吸障碍。从上世纪90年代发现以来,PRRS在全球范围迅速广泛传播,给世界养猪带来了巨大的经济损失。PRRSV在体内主要感染分化良好的巨噬细胞和肺、胸腺、扁桃体、脾、淋巴结等处的巨噬细胞。PRRSV侵染靶细胞的先决条件是与宿主细胞吸附,而宿主细胞表面的受体是完成这种吸附过程必不可少的。研究发现,硫酸乙酰肝素(Heparin Sulphate, HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin, Sn)和CD163(Cluster of Differentiation 163)分子是PAM上存在的能与PRRSV结合,介导PRRSV侵入PAM细胞、与PRRSV感染相关的三个重要受体分子。为进一步研究CD163和Sn分子在PRRSV感染过程中作用,本研究成功克隆了PRRSV的两个细胞受体CD163分子和Sn,并构建了真核表达载体PIREShyg3.0-CD163和pcDNA3.1-Sn。通过将PIREShyg3.0-CD163和pcDNA3.1-Sn分别瞬时转染PK-15细胞,利用免疫荧光和感染实验研究了CD163分子和Sn在PRRSV感染过程中的作用。结果表明:Sn和CD163都可以介导病毒的内吞进入细胞。瞬时转染Sn或CD163的PK-15细胞系都可以感染PRRSV。研究PRRSV的细胞受体和感染相关分子的特性,有助于从分子水平揭示PRRSV的感染途径及细胞内的复制过程、揭示病毒的致病机制;通过构建稳定表达病毒受体的猪源细胞系,可以获得PRRSV高效增殖的新途径,有助于研制更有效的病毒疫苗和诊断试剂。

全文目录


致谢  4-8中文摘要  8-9ABSTRACT  9-10第一章 文献综述  10-17  1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展  10-11    1.1 猪繁殖与呼吸综合征  10    1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组  10-11    1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫学研究进展  11  2 猪繁殖与呼吸综合征的抗体依赖性增强作用  11-12  3 猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展  12-15    3.1 硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate,HS)受体  12-13    3.2 唾液酸黏附素（Sialoadhesin,Sn）受体  13    3.3 CD163（Cluster of Differentiation 163）分子  13-14    3.4 波形蛋白( Vimentin)  14-15    3.5 CD151（Cluster of Differentiation 151）分子  15  4 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的免疫抑制  15  5 基因转染技术研究进展  15-16  6 本研究的意义  16-17第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体CD163、Sn 的克隆及真核表达载体的构建  17-34  1 材料  18-21    1.1 菌种、质粒  18    1.2 酶及主要试剂  18-19    1.3 主要试剂的配制  19    1.4 试剂的配制  19-20    1.5 主要仪器设备  20-21  2 方法  21-30    2.1 猪肺巨噬细胞的采集  21-22    2.2 PAM 细胞总RNA 的提取及cDNA 的合成  22-23    2.3 猪CD163、Sn 片段的克隆  23-27    2.4 真核表达载体 PIREShyg-CD163 和 pcDNA3.1-Sn 的构建  27-30  3 结果与分析  30-33    3.1 提取猪肺巨噬细胞PAM 的总RNA  30    3.2 poCD163 和Sn 基因的PCR 扩增  30-31    3.3 克隆载体PMD-19-T-CD163 和PMD-19-T-Sn 的构建  31-32    3.4 真核表达载体PIREShyg-CD163 和pcDNA3.1-Sn 的构建  32-33  4 讨论  33-34第三章 CD163 和Sn 的功能鉴定  34-52  1 材料  34-35    1.1 菌种、质粒、病毒  34    1.2 细胞及培养基  34    1.3 试剂和抗体  34    1.4 主要试剂的配制  34-35  2 方法  35-43    2.1 PK-15 转染条件的优化  35-40    2.2 CD163 和Sn 功能鉴定  40-43  3. 结果  43-50    3.1 PMD-19-T-GFP 质粒的菌液PCR 鉴定  43    3.2 真核表达质粒pcDNA3.1-GFP 和PIREShyg3-GFP 的构建  43-44    3.3 PK-15 细胞转染条件的优化  44-47    3.4 CD163 和Sn 的功能鉴定  47-50  4 讨论  50-52第四章 CD163 和FcγRⅡ在PRRSV 感染过程中的协同作用  52-55  1 材料  52    1.1 病毒、细胞和质粒  52    1.2 仪器设备  52    1.3 试剂配制  52  2 方法  52-53    2.1 pcDNA3.1- FcγRII 和PIREShyg-CD163 共转染PK-15  52    2.2 转染细胞接毒  52-53    2.3 流式细胞检测PRRSV 感染结果  53  3 结果与分析  53-55全文结论  55-56参考文献  56-59附录 参加的科研项目  59硕士期间发表的论文  59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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