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猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及猪α干扰素的真核表达

作　者: 卢晓艳
导　师: 夏平安；崔保安
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: PRRSV 变异分析 猪α干扰素 真核表达
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


PRRSV属于RNA病毒,其基因组容易发生变异,变异分布于整个基因组,其中以Nsp2和GP5基因的变异最大,因此对Nsp2和GP5基因变异的分析在一定程度上可以反映整个病毒基因组变异的情况。本研究对9株PRRSV分离株NSP2和GP5基因同时进行序列分析,比较其变异结果是否一致,进一步探寻PRRSV流行株遗传变异规律;猪α干扰素具有广泛的抗病毒作用,而真核表达的猪α干扰素具有与天然猪α干扰素相同的生物学活性,因此研究真核表达的猪α干扰素对防治PRRSV具有重要的生物学意义。扩增自2006至2009年期间从河南省不同地区分离的9株PRRSV株NSP2和GP5编码基因,并进行序列测定和分析,结果显示,9株分离株NSP2全长2850bp-2937bp,编码950-979个氨基酸,GP5基因全长603bp,编码200个氨基酸。将除HeN-3株外的其余8株分离株NSP2核苷酸序列与国内外典型株CH-1a、BJ-4、HB-1(sh)、HB-2(sh)和VR2332株进行比对,其同源性分别为91.1%-92.4%、82.3%-83.1%、94.7%-96%、87.15-87.9%、82.6%-83.5%,与河南株HN0701和HN0702的同源性为95.45-98.4%和94.1%-95.6%,而HeN-3株与BJ-4、VR2332和RespPRRSMLV株的同源性分别为99.2%、99.5%和99.5%。将除HeN-3株外的其余8株分离株GP5基因核苷酸序列与国内外典型株CH-1a、BJ-4、HB-1(sh)、HB-2(sh)和VR2332株进行比对,其同源性分别为95.2%-96.7%、94%-95.2%、95.5%-96.7%、91.9%-92.5%和88.7%-89.6%,与河南株HN0701和HN0702的同源性分别为96.5%-99.2%和96.7%-99.7%,而HeN-3株与BJ-4、VR2332和RespPRRSMLV株的同源性为98.7%、99%和99.2%,对NSP2和GP5基因同时绘制遗传进化树显示, HeN-3株与BJ-4、VR2332和RespPRRSMLV株属于一个亚型,其余8株与CH-1a、HB-1(sh)、HB-2(sh)、HN0701和HN0702株属于一个亚型,由此得到NSP2和GP5基因的变异结果基本一致,对NSP2和GP5中的任何一个基因进行遗传变异分析,都可以获得PRRSV的遗传变异信息。无菌采集健康猪前腔静脉血,分离淋巴细胞,提取总RNA,参照GenBank上已发表的猪α干扰素基因序列设计包括猪α干扰素完整开放阅读框的一对引物,应用RT-PCR方法扩增猪α干扰素基因序列,回收目的片段并将其插入到PTG19-T载体中,转化DH-5α感受态细胞,将鉴定为阳性的重组质粒进行测序,获得猪α干扰素完整开放阅读框为570bp,其核苷酸与GenBank上发表的猪α干扰素序列同源性均在95.0%以上。用EcoRⅠ和XhoI对质粒PTG19-T-poIFNα进行双酶切,回收目的基因片段,插入到真核表达载体pcDNA3.0中,构建猪α干扰素真核表达重组质粒pcDNA3.0-poIFNα,将重组质粒pcDNA3.0-poIFNα转染至PK-15细胞,用G418进行筛选。收集转染后的PK-15细胞,提取poIFNα的mRNA,经过PCR检测获得预期目的片段;应用猪α干扰素ELISA试剂盒对猪α干扰素表达蛋白进行检测,绘制标准曲线,获得猪α干扰素表达蛋白的表达量为883.94pg/ml;通过实验室建立的猪α干扰素荧光定量PCR方法,检测猪α干扰素mRNA转录水平,结果与对照组相比,猪α干扰素mRNA转录水平明显上调,结果表明成功构建稳定表达的猪α干扰素PK-15细胞系;同时利用实验室建立的PRRSV荧光定量PCR方法对猪α干扰素处理猪白细胞后接种PRRSV后的病毒量进行检测,结果表明PK-15细胞表达的猪α干扰素具有一定的抗病毒活性。

全文目录


致谢  4-6中文摘要  6-8英文缩写对照表  8-9文献综述  9-21  一 猪繁殖与呼吸综合征病毒  9-13    1 PRRSV 生物学特性及基因组特点  9-10    2 GP5 基因的遗传变异  10-12    3 Nsp2 基因的遗传变异  12-13    4 PRRSV 遗传变异分析  13  二 干扰素  13-21    1 干扰素的分类  14    2 干扰素诱导的信号转导通路  14-15    3 干扰素诱导的效应因子  15-17    4 干扰素的生物学功能  17-18    5 IFN-α分子结构和及理化性质  18-19    6 猪α干扰素分子结构和及理化性质  19    7 猪α干扰素的生物学特性  19-21引言  21-22试验一 猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析  22-41  1 材料  22-25  2.方法  25-30  3. 结果与分析  30-39  4.讨论  39-41试验二猪α干扰素的真核表达  41-55  1 材料  41  2 方法  41-46  3.结果与分析  46-53  4. 讨论  53-55全文总结  55-56参考文献  56-63英文摘要  63-65发表论文  65

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 猪
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