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猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
作 者: 曹彦琼
导 师: 姜平
学 校: 南京农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: 猪圆环病毒2型 Cap蛋白 单克隆抗体 抗原表位
分类号: S852.65
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原,并可导致机体产生严重的免疫抑制,严重影响养猪业发展。PCV2包含两个主要的开放性阅读框ORF1和ORF2,分别编码病毒复制相关蛋白(Rep)和病毒衣壳蛋白(Cap)。Cap蛋白为病毒的主要结构蛋白,在抗病毒感染免疫中起到重要的保护作用,并具有多个抗原表位。本研究以重组杆状病毒表达的重组Cap蛋白为免疫原,通过小鼠杂交瘤技术,成功制备6株抗PCV2 Cap的单克隆抗体,并对其识别的抗原表位进行了初步分析,研究内容包括:1.利用重组杆状病毒表达的PCV2 Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过3次亚克隆,用间接ELISA方法筛选阳性克隆,获得6株能稳定分泌抗PCV2 Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3。2.采用间接ELISA方法测得该6株杂交瘤细胞培养上清的效价分别为1:1024,1:1024,1:2048,1:2048,1:1024和1:1024;诱导同品系小鼠产生的腹水效价分别为1:204800,1:204800,1:1310720,1:1310720,1:163840和1:163840。体外连续培养60d,传代20次,分别取第5、10、20代的培养上清,检测其抗体效价,结果基本一致。亚类鉴定结果显示,3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为K型。Western blot分析结果表明,6株单抗均能与重组Cap蛋白和纯化PCV2粒子发生特异性反应。IFA鉴定结果表明,6株单抗均可与PCV2毒株产生特异性反应,能够识别病毒天然结构蛋白。3.通过对6株单抗的识别位点进行初步分析,发现它们针对3个不同的抗原表位,其中3H9/1H5与3H9/3C7、4A9/3E2与4A9/3D7、6G7/7B6与6G7/8D3的识别位点相似。以原核表达的5种截断重组PCV2 Cap蛋白(CapA:51-150aa,CapB:51-200aa, CapC:51-233aa, CapD:101-200aa, CapE:101-233aa)为抗原,通过Western blot分析进一步鉴定这些单抗的识别位点,发现4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101-150aa;而其余4株单抗(3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3)与原核表达的5种蛋白均不反应,其分泌抗体可能识别PCV2 Cap蛋白的天然构象表位或者1-50aa区域,从而为PCV2诊断、致病机理及Cap蛋白功能的研究提供了有用工具。
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全文目录
摘要 6-8ABSTRACT 8-10第一章 猪圆环病毒2型及其单克隆抗体的研究进展 10-32 1 猪圆环病毒分子生物学特征 10-14 1.1 病毒的分类 10-11 1.2 病毒的形态及理化特性 11-12 1.3 病毒基因组结构 12-14 2 猪圆环病毒编码蛋白 14-19 2.1 ORF1编码蛋白 14-15 2.1.1 Rep与Rep’的细胞定位 14 2.1.2 Rep与Rep’的结构功能 14-15 2.1.3 Rep与Rep’的相关位点及表位定位 15 2.2 ORF2编码蛋白 15-18 2.2.1 Cap的细胞定位 16 2.2.2 Cap的结构功能 16 2.2.3 Cap的相关位点及表位定位 16-18 2.3 ORF3编码蛋白 18-19 3 单克隆抗体研究进展 19-24 3.1 单克隆抗体技术的应用 19-21 3.1.1 检测特异性病毒或细菌 20 3.1.2 检测肿瘤抗原 20 3.1.3 检测机体内微量成分 20-21 3.1.4 治疗临床疾病 21 3.2 猪圆环病毒2型单克隆抗体研究进展 21-24 3.2.1 国外PCV2单克隆抗体研究进展 21-22 3.2.2 国内PCV2单克隆抗体研究进展 22-24 参考文献 24-32第二章 猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 32-54 1 材料 33 1.1 实验动物、细胞系及毒株 33 1.2 主要试剂 33 2 方法 33-41 2.1 重组Cap蛋白的表达 33-34 2.1.1 杆状病毒重组Cap蛋白的表达 33-34 2.1.2 大肠杆菌重组Cap蛋白的表达 34 2.2 动物免疫 34 2.3 抗体效价的测定 34-35 2.4 细胞融合 35-36 2.4.1 细胞融合前准备工作 35-36 2.5 杂交瘤细胞株的建立 36-38 2.5.1 阳性杂交瘤细胞的筛选 36-37 2.5.2 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 37 2.5.3 腹水的制备 37 2.5.4 杂交瘤细胞的冻存与复苏 37-38 2.6 单克隆抗体的鉴定 38-41 2.6.1 杂交瘤细胞培养上清及腹水效价的测定 38 2.6.2 Ig类鉴定 38 2.6.3 特异性鉴定 38-40 2.6.4 抗体分泌稳定性鉴定 40 2.6.5 单抗识别表位的初步分析 40-41 3 结果 41-48 3.1 免疫鼠血清PCV2抗体效价测定 41 3.2 杂交瘤细胞株的建立 41 3.3 单克隆抗体的鉴定 41-48 3.3.1 杂交瘤细胞培养上清及腹水效价的测定 41 3.3.2 Ig类鉴定 41-42 3.3.3 特异性鉴定 42-44 3.3.4 抗体分泌稳定性鉴定 44-45 3.3.5 单抗识别表位的初步分析 45-48 4 讨论 48-51 参考文献 51-54全文总结 54-56致谢 56-58附录 58-62
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医基础科学 > 家畜微生物学(兽医病原微生物学) > 家畜病毒学
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